纳他霉素发酵培养基及发酵条件的优化
2007-09-24 09:32:23   来源：微生物学杂志   评论：0 点击：

　　1982年和1996年,美国FDA和中国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂[1, 2]。与传统的食品防腐剂相比,纳他霉素在很低的浓度下仍具有活性,并且安全、高效、广谱。它在食品中的抗真菌作用是双效的,既可防止真菌引起的食品腐败,减少经济损失;又可防止真菌毒素的产生。目前,纳他霉素已在全世界三十多个国家得到广泛应用。我国对纳他霉素需求量很大,对纳他霉素发酵培养基及发酵条件的优化研究是提高纳他霉素产量的途径之一。褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素过程的优化手段较多,目前大多采用单因素试验[3]或是正交试验[4]。纳他霉素做为一种多烯大环内酯类抗生素,影响其合成过程的因素较多,采用单因素或正交试验工作量大、效率低,并且不能考虑两因素间的交互作用。近年来,响应面分析法(RSM)[5, 6]由于试
验次数少、周期短、求得的回归方程精度高、能确定几种因素间交互作用,并且通过多元二次回归方程的建立能精确预测最终产量,而被广泛应用于生物技术领域[7]。本研究运用SAS软件和Sta-tistica 6. 0软件[8],采用P.B.实验设计、最陡爬坡实验设计和RSM对影响褐黄孢链霉菌合成纳他霉素的发酵培养基及发酵条件进行考察和评价,确定了最优的发酵培养基及发酵条件。
1　材料与方法

1.1　材料
1. 1. 1　菌种　褐黄孢链霉菌(Streptomyces gilvos-poreus) SG2002,天津科技大学微生物制药研究室保藏菌种。
1. 1. 2　培养基(质量分数,% )　①种子培养基:葡萄糖2,蛋白胨0. 6,酵母粉0. 6, NaCl 1,pH 7. 0;②发酵培养基:葡萄糖4,蛋白胨1. 95,酵母粉0. 45, pH 7. 0。
1.2　方法
1. 2. 1　种子培养　吸取浓度为108个/mL孢子悬浮液于装有30 mL种子培养基的250 mL三角瓶中, 29℃, 200 r/min回转式摇床振荡培养至快速生长期。
1. 2. 2　发酵培养　将摇瓶种子培养液以2%的接种量转接到装液量为50 mL的500 mL三角瓶中, 29℃、200 r/min回转式摇床发酵96 h。
1.2. 3　纳他霉素产量测定方法　高效液相色谱法[9]。
1. 2. 4　发酵液中葡萄糖浓度的测定　利用SBA生物传感分析仪[4]。
1. 2. 5　数据处理　Plackett-Burman实验设计及Box-Behnken实验设计表中,自变量编码方程: xi=(Xi-X0) /ΔXi,式中xi为自变量的编码值,Xi为自变量的实际水平值,X0为实验水平中心点的实际值,ΔXi为单变量增值。
2　结果与分析
2. 1　Plackett-Burman设计法筛选显著因素Plackett-Burman设计可在一次试验中对多个独立可调变量进行考察,通过统计分析筛选出众多因素中对试验结果有显著影响的因素[10]。本试验采用N=8的Plackett-Burman设计法,对6个因素进行考察,以纳他霉素的产量为响应值。所选取的自变量及其代号、编码和水平见表1。利用SAS软件对Plackett-Burman实验结果进行方差分析(见表2)及回归方程系数显著性检验(表3),表明对纳他霉素产量影响显著的因素有蛋白胨(P=0. 064 3), pH(P=0. 035 6),装液量(P=0. 068 6)。通过逐步回归分析,获得该菌发酵合成纳他霉素的多元一次回归方程: Ynata=1. 457 5-0. 197 5x1+0. 357 5x2+0. 185x3+0. 032 5x4+0. 03x5+0. 095x6　　(式1)

式中,Ynata为纳他霉素产量的预测值。其拟合度可通过校正决定系数(Adjusted coefficientof determination,R2Adj)和相关系数(Correlation coefficien,t R2)来验证,此处R2Adj值为0. 987,表明纳他霉素产量98. 7%的变异分布在方程的6个因子中,其总变异中仅有1. 3%不能由该模型来解释,R2值为0. 998,表明产量的实测值与预测值之间具有较好的拟合度。由自变量编码方程可知,上述方程中x1=(葡萄糖-40) /10, x2=(蛋白胨-20) /10, x3=(酵母粉-5) /2, x4=(pH-7. 25) /0. 75, x5=(接种量-8. 5) /6. 5, x6=(装液量-50) /20。

2.2　最陡爬坡实验
根据式1中回归系数的符号和大小,结合实验的实际需要,在最陡爬坡实验中对影响纳他霉素产量因素的变化方向和步长进行相应设计,具体取值和实验结果见表5。而其他因素的取值则根据正效应因素均取较高值、负效应因素均取较低值的原则做如下安排:葡萄糖50 g/L,酵母粉7 g/L,接种量15%。表4列出了各显著因素的变化方向、步长和实验结果。由表4可知,纳他霉素产量在0到0+1△之间有一个明显的上升,之后开始下降,最优发酵条件在0+1△和0+2△之间,故以0+1△条件为后续实验的中心点。

2. 3　Box-Behnken实验建立多元二次模型方程及其检验
本实验采用Box-Behnken设计对蛋白胨、p和接种量进一步优化。Box-Behnken是一种寻找多因素系统中最佳条件的数学统计方法。本实验中每个因素取三个水平,根据相应的实验表进行实验后,对数据进行二次回归拟合,得到包括一次项、平均相、交互相的二次方程,分析各因素的主效应和交互效应,最后在一定水平范围内求取最佳值。Box-Behnken设计的变量及水平取值,BoBehnken设计及结果、纳他霉素产量的方差分析分别列于表5、表6和表7。

 

　　表7的方差分析表明,该回归方程显著(P=0. 008 9)。R2Adj值为0. 861 5,表明纳他霉素产量86. 15%的变异分布在方程的9个因子中,其总变异中仅有13. 85%不能由该模型来解释,R2值为0. 950 5,表明纳他霉素产量实测值与预测值之间具有较好的拟合度。因此该模型可用于预测纳他霉素产量的实际情况。

由回归方程系数显著性检验(表8)可知,因素C对纳他霉素产量线性效应显著,而因素A和B对纳他霉素产量的线性效应不显著;因素C2对纳他霉素产量其曲面效应显著,而因素A2和B2对纳他霉素产量曲面效应不显著;因素AC对纳他霉素产量交互效应比较显著,因素AB和BC对纳他霉素产量交互效应不显著。

　　表8是逐步回归分析和对各因子系数的分析,可得最优多元回归方程: Ynata=2. 023 3 +0. 183 75A+0. 12B+0. 318 75C-0. 224 167A2-0. 067 55AB+0. 2AC-0. 266 667B2+0. 072 5BC-0. 379 167C2　　(式2)

　　由自变量编码方程可知,方程中A=(蛋白胨-18. 5) /1. 5, B=(pH-7. 7) /0. 2, C=(装液量-55) /5。通过多元回归方程(式2)对3个关键因素及其交互作用所做响应曲面及等高线见图1至图3。

　　图1显示了在装液量为最佳(60 mL)时,蛋白胨与pH对纳他霉素产量的交互影响效应。从其等高线图可以直观地看出此两因素的交互作用不显著,因为等高线的形状反映出交互效应的强弱大小,圆形表示两因素交互作用不显著,而椭圆形则表示两因素交互作用显著。由图1可知,蛋白胨与pH不存在交互作用。图2显示了在pH为最佳(7. 4~7. 5)时,蛋白胨与装液量对纳他霉素产量的交互影响效应。从其等高线图可以直观的看出此两因素的交互作用显著。由图2可知,蛋白胨与装液量都很高时,纳他霉素产量较高,都低时纳他霉素产量较低。由此可知,在实验水平范围内,适当提高蛋白胨与装液量。图3显示了在蛋白胨为最佳(19. 5 g/L)时, pH与装液量对纳他霉素产量的交互影响效应。从其等高线图可以直观看出此两因素的交互作用不显著, pH与装液量不存在交互作用。由等高线图和响应面图可知,回归模型存在最大值,即在蛋白胨19. 5 g/L、pH 7. 4~7. 5、装液量60 mL/500 mL的条件下,纳他霉素最大值为2. 19 g/L。

2.4　验证实验
在优化后的培养基及培养条件下进行5组平行试验,所得纳他霉素的产量分别为2. 19、2. 16、2. 14、2. 12、2. 09 g/L,平均值为2. 14 g/L。回归方程所得到的纳他霉素产量的预测值(2. 19g/L)与验证试验的平均值(2. 14 g/L)相接近,说明回归方程能够较真实地反映各筛选因素对纳他霉素产量的影响,证明应用响应面法优化褐黄孢链霉菌合成纳他霉素发酵培养基及发酵条件可行,回归模型较可靠。

3　小　结
　　利用SAS, Statistica 6. 0等软件,通过Plack-ett-Burman设计法、最陡爬坡实验和响应面(Box-Behnken设计法)对褐黄孢链霉菌发酵合成纳他霉素的发酵培养基及发酵条件进行了优化,并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验,优化了内在因素水平,探讨了各因素间的交互作用,并对实验结果进行数学模拟和预测,从而以最经济
的方式高效、准确地得到优化结论。优化后得到的培养基组成为葡萄糖50 g/L、蛋白胨19. 5 g/L、酵母粉7 g/L、pH 7. 4~7. 5;发酵条件为装液量60 mL/500 mL、接种量15 %、发酵温度29℃、摇床转速200 r/min、发酵周期96 h。在此条件下,通过验证实验证明纳他霉素的产量达到
2. 14 g/L,比优化前提高了94%。实验结果证明,采用Box-Behnken统计学实验设计方法对纳他霉素发酵培养基及培养条件进行优化,不仅科学合理,而且快速有效。