CoQ10高产菌株选育的研究进展
2012-01-30 23:01:18   来源:   评论:0 点击:

1 引言    辅酶 Q10 (Coenzyme Q10,CoQ10),又名泛醌、癸烯醌,为脂溶性醌类化合物,化学名称为:2,3-二甲氧基-5-甲基6-癸异戊烯基苯醌。1957 年首先由美国的Frederick Crane 等发现[1]并命名。1978...

1 引言
  
  辅酶 Q10 (Coenzyme Q10,CoQ10),又名泛醌、癸烯醌,为脂溶性醌类化合物,化学名称为:2,3-二甲氧基-5-甲基6-癸异戊烯基苯醌。1957 年首先由美国的Frederick Crane 等发现[1]并命名。1978 年Peter 用化学渗透理论解释了生物能量转移中CoQ10 起到重要的质子转移作用,获得了诺贝尔奖[2]。CoQ10 广泛存在于动物肝脏、肾脏、植物细胞及除革兰氏阳性细菌和蓝细菌以外的微生物中,是生物细胞呼吸链中的重要递氢体,参与ATP 的形成,具有保护和恢复生物膜结构的完整性、稳定膜电位和增强免疫反应等作用[3,4]。Papucci 等[5]证明了辅酶Q10 可以阻止细胞凋亡的传导信号。 CoQ10 作为一种良好的生化药物,临床上可用于心力衰竭、冠心病、高血压病、糖尿病、癌症、艾滋病、急慢性肝炎、帕金森症等多种疾病的辅助性治疗。另外,CoQ10 作为一种天然抗氧化剂,具有抗衰老作用,从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域,市场前景十分广阔[6-8],在日本及欧洲国家,关于辅酶Q10 的基础研究和临床研究已广泛深入地展开,目前涉及辅酶Q10 的独立成分或复合成分的药品超过100项[9] 。
  微生物发酵法具有产物活性高、原料成本低、易控制及可以通过发酵罐实现工业化生产等特点,被认为是目前最有发展潜力的辅酶Q10 生产方法[10]。当前制约微生物发酵法生产CoQ10 的主要因素就是难以获得可用于工业化生产的优良菌株,目前的研究热点集中在通过多种方法获得高产CoQ10 菌株,以及采用多种技术对现有的CoQ10 产生菌进行改良。
  
  2 产生CoQ10 的菌株
  
  自 20 世纪70 年代以来,研究人员通过从自然界直接筛选及改良获得了众多的CoQ10产生菌株,包括细菌、真菌和酵母等[11-25]。野生型的菌株CoQ10 含量不高,同时在耐受性、培养条件及分离纯化等环节也有诸多问题。随着科学技术的日新月异,如何对现有的菌株进行改造使其可用于CoQ10 工业化生产成为当前的主要研究方向。
  
  3 CoQ10 高产菌株的选育策略
  
  在生物进化过程中,微生物形成了愈来愈完善的代谢平衡调节机制,正常代谢的微生物是不会有过量CoQ10 的积累,要想通过微生物方法大量产生CoQ10,必须突破或解除微生物正常的代谢调控,改变其体内的物质代谢平衡,从而使其大量合成CoQ10。
  虽然在原核细胞和真核细胞中合成CoQ10 的前体物质来源不同,但其合成途径主要由以下三个部分构成:即芳香环前体的合成、聚十异戊烯基焦磷酸侧链的合成和芳香环的修饰三部分[26]。通过研究CoQ10 在菌体内的合成过程可以为菌种改良提供理论依据。
  芳香环的合成前体是对羟基苯甲酸(PHB),在大肠杆菌中,CoQ10 生物合成的第一步是从分枝酸合成对羟基苯甲酸,此步反应由ubiC 基因编码的丙酮酸合成酶催化。在酿酒酵母中,对羟基苯甲酸可通过两种途径加以合成:由分支酸进行裂解合成;对酪氨酸进行一系列脱氨、酰化、去酰化反应从而合成。
  聚异戊烯侧链的合成前体是异戊烯基焦磷酸(IPP)和二甲基烯丙焦磷酸(DMAPP)。二者之间可由IPP/DMAPP 异构酶互相转化。在酵母中这2 种前体通过甲羟戊酸途径(mevalonatepathway,MVA)得到,而细菌中则通过2-C-甲基-4-磷酸-D-赤藓糖醇途径(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate,MEP)来获得。参与聚异戊烯侧链合成的关键酶包括hmgR 基因编码的HMG-CoA 还原酶、ispD 基因编码的2-甲基-4-胞苷二磷酸-D-赤藓糖醇合成酶、ispF 基因编码的2-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶、GPP 合成酶、FPP 合成酶、GGPP 合成酶、dps 和ddsA 基因编码的十异戊二烯焦磷酸合成酶等。
  目前的研究表明,芳香环的修饰主要包括一次异戊二烯化、一次脱羧、三次羟基化及三次甲基化反应,但大肠杆菌与酿酒酵母在修饰反应的先后顺序上存在部分差异。参与芳香环修饰的关键酶包括ubiA 或coq2 编码的对羟基苯甲酸聚异戊二烯焦磷酸转移酶、3- 十聚异戊二烯基-4- 羟基苯甲酸脱羧酶、甲.
  
  3.1 传统诱变育种获得CoQ10 高产菌株
  作为经典的微生物育种方法,传统诱变育种在获得 CoQ10 高产菌株方面发挥了重要作用。作为次级代谢产物, CoQ10 在体内合成过程复杂,通常不分泌到胞外,因此筛选方法受到制约。目前常以表型改变、营养缺陷型和合成过程相关化合物的结构类似物进行筛选。
  Yoshida 等[19] 对R.sphaeroides KY-4113 进行诱变筛选,获得一株绿色突变株,其 CoQ10含量比野生株提高20%;姚文兵[27]等通过紫外照射和离子束注入诱变,用含辅酶Q10 结构类似物和呼吸链抑制剂Na2S 的抗性平板定向筛选辅酶Q10 高产菌,结果辅酶Q10 产量比原始菌株提高了58%。Rupert 等[28]对锁掷酵母属sporidiobolus ruineniae 用紫外、NG 等方法诱变后在含百草枯、维生素K3 或抗霉素等平板上筛选出具有抗性的诱变株,后再经发酵条件的优化产率由原来的0. 95 mg/ g DCW,生物量8.2mg/ L 提高到22.9mg/ L ,CoQ10 含量为3.5DCW。乔志新等[25]通过Co60 照射对类球红细菌进行诱变,通过高通量筛选平台获得的突变株中CoQ10 的含量达到了8.31 mg/g DCW,较出发菌株R.S 提高了3.90 倍。
  而目前报道的CoQ10 的最高产量为770mg/L[21],其产生菌类球红假单孢菌突变株KY-8598 是由化学诱变所得,经发酵150 h,CoQ10 产量可高达770 mg/L 和14 mg/g DCW。但是,由于传统诱变方法的非定向性、随机性、低效性,传统诱变方法筛选CoQ10 突变株工作量大且时效长,只有在具有高通量筛选平台的前提下才具有可行性。
  
  3.2 基因工程获得CoQ10 高产菌株
  利用分子生物学技术找到CoQ10 合成过程中的关键酶基因,通过重组DNA 技术将该基因引入宿主菌,使关键酶基因拷贝数增加并高效表达,从而增强合成CoQ10 的能力,这是构建CoQ10 基因重组菌株的基本路线。
  Matsuda H 等[29]从真菌Bulleromyces 属中分离得到关键酶十异戊二烯焦磷酸合成酶的基因,通过pNTB1 载体整合到Escherichia coli DH5α 表达得到CoQ10;Bing Cheng & Qi-pengYuan 等[30]通过表达载体使编码HMG-CoA 还原酶的hmgR 基因在Schizosaccharomycespombe 中过表达,结果发现其CoQ10 的产量在不添加花生四烯酸和添加花生四烯酸的情况下氧基转移酶和ubiE 基因编码的甲基转移酶等。分别提高到2.68 和3.09 倍。Jin-Ho Choia, Yeon-Woo Ryub 等[31]通过基因工程方法构建了一株大肠杆菌突变株, ispB 基因的敲除阻断了CoQ8 的合成使其只能表达CoQ10,同时异源Dps 基因的表达和Dxs 基因的过表达使其可以高产CoQ10,最终的突变株中CoQ10 的浓度为99.4mgl?1,提高了78 倍。
  而Cheong 等[32]则将十异戊二烯焦磷酸(DPS)合成酶基因和1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)基因一起插入载体pGPRX11 中,通过质粒转化入Agrobacterium tumefaciensBNQ-pGPRX11(KCCM210554)中表达,得到CoQ10 的高产菌,通过发酵工艺优化后得到CoQ10 的产量为642.1mg/L,为利用基因工程菌进行CoQ10 的工业化生产奠定了基础。
  
  3.3 基因组改组技术获得CoQ10 高产菌株
  基因组改组技术(Genome shuffling)是分子定向进化在全基因组水平上的延伸,将改组的对象从单个基因扩展到整个基因组,是Maxygen 公司的Stemmer 等于1998 年提出的一种新的体内分子育种方法,它通过对多个正向突变体递进融合(recursive fusion)来进行基因组随机重组,快速筛选所需表型有重大改进的菌株。该技术对于多基因多途径调节的复杂的产物代谢具有显著的效果。
  乔志新等[25]采用基因组改组的方法结合传统诱变育种方法快速融合多种正向突变从而获得高产CoQ10 的菌株,经过一轮改组就得到同时融合了硫化钠抗性和对羟基苯甲酸抗性的突变株PN13,其CoQ10 含量达到了4.31mg/g,比出发菌株提高了2.02 倍。
  王飞飞等[13]通过原生质体融合对产生CoQ10 的根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和深红红螺菌(Rhodopseudomonas rubrum)进行改组,经过摇管初筛和摇瓶发酵复筛之后,筛选出一株性能比出发菌株显著提高的菌株A-Rh15,其辅酶Q10 产量15.0278mg/L,较出发株提高156.46%;每克干细胞含CoQ10 2.8145 mg,较出发株提高了69.53%。
  
  3.4 可用于CoQ10 高产菌株选育的新技术
  通过传统诱变、代谢工程、基因组改组等手段虽然可以提高微生物的辅酶Q10 产量,但是效率相对较低,提高程度有限,要想通过这些方法在短期内使菌株达到工业化生产的要求是非常困难的。由于对基因组研究的深入,研究者意识到只有从基因组水平上对控制目的表型的多个基因同时进行修饰,才有可能快速得到目的表型。下面要介绍的全局转录调控(gTME)和瞄准突变的复合自动化基因组工程(MAGE)就是两种通过对多基因同时操作进行微生物选育的方法,具有很大的发展潜力。
  3.4.1 全局转录调控(gTME)
  2006 年麻省理工大学的Alper H[33]提出了全局转录调控的概念, gTME 主要通过对调控基因转录的转录元件(原核生物的σ 因子、真核生物的SPT15 和TAF25 等各种转录因子)进行合理化改组修饰(如易错PCR、DNA shuffling 等),改变RNA 聚合酶对启动子的亲和能力和转录效率,使得整个基因组的转录发生全局性变化,从而导致多基因控制的复杂的细胞表型得到改变,最终通过特定的筛选获得需要的优良表型。Alper H 等[34]在对获得的含有改组修饰的SPT15 和TAF25 突变菌种库中进行筛选,获得的SPT15-300 突变株在含有6%乙醇和120g/L 葡萄糖的培养基中的生长速度达到了野生菌株的13 倍,甚至可以在高达20%乙醇的培养基中继续生存。于慧敏等[35]利用gTME 的方法获得高产透明质酸的大肠杆菌,其中经转化入突变rpoD 基因筛选获得的D72 菌株透明质酸的发酵水平达到561.4 mg/L,透明质酸的细胞干重含量达到了265mg/g。
  gTME 着眼于整个基因组的转录调控,对基因的转录识别、激活与控制进行改变,使得整个基因组的转录发生全局性的改变,它克服了传统方法只对某一个或几个基因进行修饰的局限性,对于像CoQ10 生产这种由多基因控制的、代谢调控比较复杂的过程往往会有意想不到的效果。
  3.4.2 瞄准突变的复合自动化基因组工程(MAGE)
  MAGE 是2009 年由哈佛医学院的George M. Church 等[36]提出的, MAGE 提供了一个高效、低廉、自动化的方法对基因组中的多个目标位点(基因、调控区域等)同时进行累积突变。首先针对每一个目标位点都合成一段带有简并序列并且与目标位点具有一定同源性的寡核苷酸片段,这些片段可以在染色体复制过程中在目标位点引入突变,由于含有兼并序列,因此在一个位点就可以引起大量的突变。然后将针对所有目标位点设计的众多寡核苷酸片段同时导入细胞体内,通过筛选获得具有目标表型的突变株。George M. Church 等通过MAGE对大肠杆菌突变株EcHW2 中与番茄红素合成有关的24 个基因同时进行改造,经过6 轮MAGE 改组,获得的高产突变株番茄红素产量达到9000ug/g(干重),比初始菌株EcHW2 提高了5 倍。同时George M. Church 通过MAGE 对大肠杆菌的基因组进行改组使外源氨基酸更容易整合进相关蛋白中,从而获得了安全性更高、具有多重病毒抗性的菌株。
  MAGE 可以同时对与目标代谢途径相关的所有基因进行重复性和大规模的突变,在短期内产生数量巨大的突变库,从而极大地提高突变、筛选效率,这是一个极具应用前景的微生物育种技术,可以尝试将其应用到高产CoQ10 的菌株选育工作中。
  
  4 总结
  
  随着社会的发展和对CoQ10 认可度的增加,CoQ10 的社会需求越来越大,使得开发CoQ10生产新工艺、大幅度降低CoQ10 生产成本变得急需而迫切。要想实现高效、低廉地工业化生产CoQ10,除了综合利用传统诱变、基因工程、基因组改组、gTME 和MAGE 等各种技术获得高产菌株外,还要考虑发酵过程的优化控制、发酵产物的分离纯化等各方面的因素。本实验室通过gTME 对类球红细菌进行改组使其高产CoQ10,现已取得一定的进展。 

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