黑曲霉发酵生产壳聚糖工艺研究
2007-10-21 21:49:00   来源:化学与生物工程   评论:0 点击:


  壳聚糖(Chitosan,简称CTS)即脱乙酰基甲壳素,是甲壳素经浓碱溶液处理后脱去乙酰基的产物,甲壳素与壳聚糖可分别看作是纤维素的C2位-OH基被-CH3CONH基和-NH2基取代后的产物[1,2]。壳聚糖是自然界中唯一大量存在的碱性多糖[3,4]。发酵法制备壳聚糖具有一定优势,但目前还处在实验室阶段,发酵前期培养成本较高,菌丝体提高幅度不大,使生产成本相应较高。作者以黑曲霉为实验材料,研究在常用培养基中加入酒糟为原料培养基摇瓶发酵培养黑曲霉菌丝体的工艺条件,并扩大到15 L气升式发酵罐,对理化参数进行了分析。
1 实验
1·1 菌种、原料与仪器
黑曲霉(Aspergillus niger),四川理工学院生物工程实验室提供,冷藏。酒糟,自贡荣县旭川酒厂;玉米粉,市售;葡萄糖(分析纯),中国医药(集团)上海化学试剂公司。HH·B11·500-BS-Ⅱ型电热恒温培养箱,上海医疗器械厂;HZQ-F型恒温培养摇床,苏州威尔实验用品有限公司;D8023CTL-K4型微波炉,广东格兰仕集团有限公司;15 L气升式外环流发酵罐,南京汇科生物工程设备有限公司。
1·2 方法
1·2·1 黑曲霉摇瓶发酵生产壳聚糖工艺确定
首先对摇瓶发酵温度、摇床转速、发酵时间通过单因素实验分别确定最佳方案。再在已有黑曲霉发酵基础培养基上,加入酒糟,取碳源中葡萄糖、酒糟及酒糟形式3个因素在3个水平上进行L9(34)正交实验,确定最佳配方。
1·2·2 黑曲霉发酵生产壳聚糖在15 L气升式发酵罐中的参数动态分析
(1)斜面孢子培养基的制备。
(2)种子液的培养。
(3)发酵液的配制:按比例配制发酵培养基,移入15 L发酵罐中。根据实验室装料经验和许可装料12·5 L,按厂家说明书进行一系列操作,发酵罐压维持在0·08 MPa,等待接种。
(4)发酵:在火焰灭菌的条件下将摇瓶种子液按20%的量迅速从加料口倒入,调节空气流量至所需值通风量12·5~15 L·min-1,稳定后,调DO读数为100%,记录发酵开始的时间,定时取样分析生物量、残糖含量等,直至发酵结束。
(5)参数动态分析:每隔10 h取样,平行测定3次,取平均值作为测量结果,直到菌丝体干重稳定为止。
1·2·3 壳聚糖的提取
离心分离得到菌体→洗涤干净→加入7%氢氧化钠50℃下处理3 h→离心洗涤至上清液无色→微波480 W下20%氢氧化钠(料液比1∶10,质量体积比)作用15 min→离心洗涤至上清液呈中性→100℃下5% HAc(料液比1∶15,质量体积比)处理5 h→离心获得上清液,调节pH值为8→离心洗涤沉淀→50℃下真空干燥。
1·3 检测方法
菌体干重(生物量DCW)测定:离心取菌体,水充分冲洗,布氏漏斗抽滤至表面干燥,取出菌体称湿重。将湿菌体放置干燥箱内60~70℃干燥24 h至恒重,称菌体干重[5]。还原糖(残糖含量)测定:离心后取上清液采用快速斐林试剂法进行操作[6]。壳聚糖产率计算:

 

发酵液及菌丝体中镁离子含量测定:参考文献[7],用ICP测定其中的镁离子含量。脱乙酰度测定:参考文献[5,8],采用碱量法。
2 结果与分析
2·1 发酵条件的确定
2·1·1 温度对产率的影响
在不同发酵温度,转速为200 r·min-1,培养80后比较壳聚糖产率,结果见表1。

 

由表1可知,随着温度逐渐上升,壳聚糖产率也增加,在28℃达到最大,随后呈下降趋势,这符合黑曲霉的生长条件。适合于制备壳聚糖的黑曲霉培养温度在26~30℃,选择最佳温度为28℃。
2·1·2 转速对产率的影响
发酵温度控制在28℃,摇床分别取不同转速,培养80 h后比较壳聚糖产率,结果见表2。

 

由表2可知,转速小于180 r·min-1时,壳聚糖产率随转速增大而增加,大于180 r·min-1时,壳聚糖产率趋于稳定。另外,转速若过大会破坏菌丝体,致使其断裂。从经济角度考虑,选择最佳黑曲霉培养转速为180 r·min-1。
2·1·3 培养液pH值的确定
有实验表明,在培养过程中,pH值对生成壳聚糖的脱乙酰度影响较大,通过改变pH值可获得脱乙酰度不同的壳聚糖,经过反复实验,确定最佳pH值为7·4~7·6,实验操作时中性即可[9]。
2·1·4 培养时间对产率的影响
发酵温度控制在28℃,摇床转速为180 r·min-1,在培养过程中每间隔12 h测定壳聚糖产率,结果见表3。

 

由表3可知,适时收获是个很关键的问题,培养初期菌丝体迅速生长,壳聚糖的量也迅速增加。随着培养时间的延长,逐渐达到饱和,菌丝体和壳聚糖的量也不再增加;另一方面,壳聚糖的相对分子质量随着培养时间的延长而迅速下降。最佳培养时间为75~90 h,本研究中选择80 h。
通过上述实验,确定了黑曲酶发酵生产壳聚糖的最佳条件为:培养温度28℃、摇床转速180 r·min-1、pH值中性、发酵时间80 h,此时,壳聚糖产率15·31%。
2·2 含酒糟培养基发酵实验
为降低培养基成本和废物利用,在培养基中加入酒糟进行发酵。参考文献[7]给出了培养基中最佳玉米浆与葡萄糖的配比,酒糟属于碳源,氮源玉米浆含量%不变,葡萄糖含量与酒糟含量进行正交设计,酒糟以原始潮湿酒糟、烘干磨碎酒糟、烘干未磨碎酒糟三种形式参与发酵,发酵条件按上述最佳方案进行操作,培养液200 mL,L9(34)正交实验结果和极差分析见表4。
由表4极差分析可知酒糟形式对菌体干重的影响最大。较佳配方为:玉米浆4%,葡萄糖3%,烘干磨碎酒糟4%,硫酸镁1%,接入孢子量1·5 mL。验证发酵时,菌丝体进行镜检发现菌丝粗壮,菌球较少,菌丝发散,有极少量断裂菌丝。所得菌丝体干重达20·8 mg·mL-1,与优化前未加酒糟时的20·85 mg·mL-1基本相当,达到了降低培养基成本和废物利用的实验目的。
 
2·3 发酵罐中参数的测定
选择温度28℃,通气量15 L·min-1,pH值为自然pH值,在15 L发酵罐中测定生物量、残糖含量、pH值的变化曲线,结果见图1。

 

从图1可以看出,生物量先平稳增加至最大,然后缓慢下降。0~70 h平稳增加,在70 h左右达到最大生物量20·8 g·L-1,此时壳聚糖产量为3·2 g·L-1,然后生物量开始下降。结果表明发酵时间70~80 h时生物量变化不大,仍可取发酵时间为80 h。从图1还可以看出,残糖含量先平稳下降,在60 h左右达到最小值1·02%,此后略有上升,基本不变。从图1还可以看出,pH值几乎没有发生变化,在发酵中仍可让pH值自然。而pH值为6,不再显中性,可能是由于黑曲霉发酵形成了微量酸。利用ICP仪器测定了发酵罐中发酵液和干菌丝体中镁离子含量的变化曲线,结果见图2。

 

从图2可以看出,在发酵液中镁离子含量基本稳定,说明菌体对镁离子的利用率低,镁离子只起催化作用,对甲壳素合成酶活性起到激活作用,而菌丝体中的镁离子含量也相对稳定,表明硫酸镁对黑曲霉生长只有刺激作用[10]。
3 结论
(1)对黑曲霉发酵生产壳聚糖的发酵条件进行了研究。200 mL培养基组成为:玉米浆4%、烘干磨碎酒糟4%、葡萄糖3%、硫酸镁1%。接入1·5 mL(7×108~9×108个孢子)·mL-1的菌悬液,在培养温度28℃、摇床转速180 r·min-1、pH值中性下发酵80h,壳聚糖产率为15·31%。
(2)加酒糟培养基培养黑曲霉菌丝体长势较好,能够得到壳聚糖,达到降低成本、废物再利用的目的。
(3)15 L发酵罐中优化发酵工艺为:发酵液组成玉米浆4%、烘干磨碎酒糟4%、葡萄糖3%、硫酸镁1%,摇瓶种子液按20%的量迅速从加料口倒入,调节空气流量至所需值通风量12·5~15 L·min-1,调DO读数为100%,在培养温度28℃、发酵罐压维持在0·08 MPa、发酵时间80 h的条件下菌体干重为20·8g·L-1、壳聚糖产量为3·2 g·L-1。
(4)对发酵罐中黑曲霉发酵时的生物量、pH值、残糖含量进行了分析,并测定了菌丝体中镁离子的含量。生物量在0~70 h平稳增加,70 h左右达到最大20·8 g·L-1后,开始下降;残糖含量在0~60 h下降,在60 h左右达到最小值1·02%,此后略有上升,基本不变;pH值几乎没有发生变化。发酵液和干菌丝体中镁离子含量基本稳定,不随发酵时间变化。









 

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