均匀设计法优化咪唑立宾发酵培养基配方
2011-08-15 12:13:12   来源：   评论：0 点击：

作者：关亚鹏 娄忻 张莉 刘靓 张玉莲 刘静
【摘要】  本文采用均匀设计试验方法对咪唑立宾的发酵培养基配方进行优化，考察淀粉、麸质粉、黄豆饼粉和葡萄糖对其发酵效价和菌体生长量的影响，得到了四个因素的优化配比(淀粉1.8%，麸质粉1.5%，黄豆饼粉2.5%，葡萄糖0.6%)，发酵效价比对照培养基提高约21.3%。
【关键词】  咪唑立宾； 均匀设计法； 发酵培养基； 优化
ABSTRACT Uniform design method was used to optimize the fermentation medium of mizoribine. The effects of starch, corn gluten, soybean meal and glucose on titers and packed mycelial volume of mizoribine were studied. The optimum medium contains 1.8% starch, 1.5% corn gluten, 2.5% soybean meal and 0.6% glucose. Under the optimum condition, the titers of mizoribine was 21.3% higher than that in the control medium.
KEY WORDS Mizoribine; Uniform design; Fermentation medium; Optimization
咪唑立宾(mizoribine，MZR)是1971年由日本 科学 家从Eupenicillum brefeldianum的培养液中分离得到的一种咪唑类核苷，其化学名为5?羟基?1?β?D?呋喃糖基?1H咪唑?4?羧酰胺，属新型免疫抑制剂之一［1，2］，临床上主要用于肾脏移植术后排异反应的预防， 治疗 狼疮性肾炎、类风湿性关节炎、肾病综合征及系统性红斑狼疮等［3～5］。由于从土壤中筛选得到的其野生型产生菌的发酵效价比较低，不具备产业化的能力，所以近年来对其产生菌的选育和培养基优化的研究工作一直在进行。
均匀设计法已经广泛应用于科研和生产的各个方面［6，7］，它在多因素、多水平的试验设计场合比正交试验设计具有更大的优势［8］。本文以均匀设计方法为基础，对实验室保存的一株咪唑立宾产生菌的发酵培养基配方进行优化，得到了四个主要因素的最优配比，优化后配方的发酵效价比对照培养基提高21.3%。
  1 材料和方法
1.1 菌种
正青霉MZ?50(本实验室编号)，实验室保存。
1.2 培养基
斜面培养基 PDA，琼脂，蒸馏水配制。
种子培养基 淀粉，葡萄糖，黄豆饼粉，酵母粉，氯化钠，硫酸镁，碳酸钙，pH7.0。
发酵培养基(对照) 淀粉，麸质粉，黄豆饼粉，葡萄糖，pH 自然 。
1.3 摇瓶培养
单菌落转接于斜面，待长出丰满孢子后接种于种子培养基中，26℃下培养44～48h，然后以2.5%的接种量接种于发酵培养基中，26℃摇床培养4d，放瓶测定效价。1.4 测定方法
(1)菌体生长量(packed mycelial volume，pmv，%) 取发酵液10ml，3000r/min离心15min，下层菌丝体体积占发酵液体积的百分比即菌体生长量。
(2)发酵效价(u/ml) HPLC法。
1.5 实验设计
设淀粉、麸质粉、黄豆饼粉、葡萄糖四个因素分别为自变量X1、X2、X3和X4，相对发酵效价和菌体生长量分别为因变量Y1和Y2，各因素及水平列表1。根据均匀设计V4.0版软件提供的模型，设计实验。
  2 结果和分析
2.1 实验结果
根据上述设计进行实验，所得实验结果列表2。
利用均匀设计软件进行分析，采用最优回归子集法得到相对发酵效价(Y1)对4个因素淀粉(X1)、麸质粉(X2)、黄豆饼粉(X3)、葡萄糖(X4)的回归方程为：
Y1=722.30+866.98X4+62.40X1X3-
48.82X2X3-841.34X24 R2=0.9997
采用自选变量法分析得到菌体生长量(Y2)对麸质粉(X2)和葡萄糖(X4)的回归方程为：
Y2=55.91-15.99X4+13.20X2X4+26.95X2X4
R2=0.9997
对回归方程的各项参数进行方差分析，结果见表3和表4，得到的最优解列表5。 表1 U6(64)实验因素及其水平表2 U6(64)实验结果 以上发酵效价为相对值，即设对照组的发酵效价为100，
发酵效价为三次平均值。 表3 Y1回归方程的方差分析表4 Y2回归方程的方差分析表5 最优解由回归方程的方差分析表可见，Y1回归方程的F值大于F0.05(4，1)，Y2回归方程的F值大于F0.05(3，2)，相关系数R2值和p值都很合理，说明方程拟合很好，方程有极其显著的意义，图1～4为各因素对发酵效价和菌体生长量的影响趋势图。
2.2 验证实验
对表5得到的综合最优解条件进行三批验证实验，测定发酵效价和菌体生长量，每批实验取3个样品平均值，结果见表6。
经验证，在表6所列的最优发酵配方条件下，发酵效价相比对照平均提高约21.3%，菌体生长量为46%，两项指标均优于设计实验中各组配方。
2.3 分析
由发酵效价和菌体生长量的回归方程可见，淀粉和黄豆饼粉对发酵效价起正交互作用，麸质粉和黄豆饼粉对发酵效价起负交互作用；麸质粉和葡萄糖对菌体生长量起负交互作用，但作用并不严重。根据软件作图可以更加直观地看出，淀粉和黄豆饼粉对发酵效价表6 验证实验结果产生正影响(图1和图3)，麸质粉对发酵效价和菌体生长量产生负影响(图2)，葡萄糖对发酵效价和菌体生长量影响复杂但有明显的最优值出现(图4)。
由于咪唑立宾主要是胞外产物，在发酵效价可观的情况下，发酵结束时菌体浓度越低越有利于后面的发酵液过滤和提取过程，即菌体浓度低而发酵效价高的配方是理想的选择，所以因变量Y1(发酵效价)的权重取为1，因变量Y2(菌体生长量)的权重取为-1进行最优解分析。综合以上分析，由软件 计算 得到的最优解是可行的，即淀粉1.8%，麸质粉1.5%，黄豆饼粉2.5%，葡萄糖0.6%。
  3 结论
采用均匀设计法对咪唑立宾的发酵培养基配方中的主要组分淀粉、麸质粉、黄豆饼粉和葡萄糖的含量进行优化，实验结果表明，各因素对发酵效价和菌体生长量均有一定的影响，最后确定各因素的含量为淀粉1.8%，麸质粉1.5%，黄豆饼粉2.5%，葡萄糖0.6%，经多批实验验证发酵效价比对照平均提高21.3%左右。
另外，对培养基配方进行优化只是提高发酵效价的途径之一，若要全面提高菌株的发酵能力，菌种的选育和发酵工艺的优化也是很重要的研究方向。
【 参考  文献 】
［1］ 吴雪梅，张富斌，曹静懿. 新型免疫抑制剂——咪唑立宾［J］.  中国 临床药学杂志，2003，12(3)：185～186.

［2］ 董亚琳，董海燕. 免疫抑制剂咪唑立宾的药理作用及临床应用［J］. 中国新药杂志，2005，14(7)：930～932.

［3］ Ishikawa H, Tsuchiya M, Itoh H. Mizoribine: experimental and clinical experience［M］//Ponkieniez K W, Goldstein B M, eds. Inosine monophosphate dehydrogenase: a major therapeutic target. Woshington: American Chemical Society,2003:294～327.

［4］ 王意如. 免疫抑制剂研究新进展［J］. 中国新药杂志，2002，11(7)：512～515.

［5］ 钱叶勇，石炳毅，郝建华，等. 咪唑立宾在肾移植术后的应用［J］. 中华器官移植杂志，2006，27(12)：723～724.

［6］ 王艳，周林，张蓝之，等. 均匀设计法优化乳酸氧化酶提取工艺［J］. 食品研究与开发，2006，27(10)：72～75.

［7］ 周兴挺，徐会根，罗定军. 洛伐他汀发酵培养基配方的均匀设计优选［J］. 中国抗生素杂志，1999，24(1)：22～23.

［8］ 智翠梅. 均匀设计及优化［J］. 化工中间体，2007，(3)：7～10.中