大豆生物活性肽的制备及其生物活性研究
2007-09-02 21:13:39   来源:China Brewing   评论:0 点击:


大豆生物活性肽是以大豆为基本原料,通过现代生物技术将大豆球蛋白转化为小分子肽。研究发现,蛋白质并非需要在肠道中彻底分解为游离氨基酸后,才能被机体所吸收利用,许多蛋白质分子中隐含着某些活性片断,它们在消化过程中释放出大量的短链多肽物质,对人体具有多种特殊的生理调节作用。这些生物活性肽在进入人体后,可产生类似激素活性物质的作用。现已发现源于食物蛋白质的酶解物的一些特殊的序列,具有促进吸收、降血压、调节血清中血脂水平、促进钙质吸收等功能。这些低肽不仅能提供人体生长发育所需营养物质,且同时具有防病、治病、调节人体生理机能的功效,因而人们有可能从食品蛋白质中生产满足人们特定需要的活性肽。特别是许多活性肽的组成氨基酸并不一定是必需氨基酸。这就人类更充分利用蛋白质资源,尤其那些原本认为生物效价不高的蛋白质资源,生产能更好满足人类保健需要的食品基料提供了新的机遇[1]。
本文利用2709碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白,对制备大豆生物活性肽及其生物活性进行了研究。
1试验材料和方法
1.1试验材料
大豆分离蛋白:吉林不二蛋白有限公司;2709碱性蛋白酶(2.16×106U/g):北京美的生物技术有限公司;
Wister大鼠、昆明种小鼠:吉林大学动物实验站。其他化学试剂均为分析纯。
1.2试验设备
PHS-3C精密pH计:上海精密科学仪器有限公司;电子微量泵:浙江新昌国康仪器厂;核酸蛋白检测仪HD 21C-A:上海康华生化仪器制造厂;电子天平:德国赛多利斯股份公司。
1.3测定方法
酶活力的测定:Folin-酚法[2];蛋白质含量测定:微量凯氏定氮法[3];水分的测定:真空干燥法[4];灰分的测定:高温炉600℃灰化[5];糖分的测定:蒽酮比色法[6];氮溶指数(NSI)的测定:微量凯氏定氮法[3];水解度(DH)的测定;TCA法[7]。取10mL酶解上清液加入10mL 10%三氯醋酸(TCA)溶液,混合振荡,静置30min后,在4000r/min离心30min,取上清液,蛋白质总氮和上清液可溶性氮由凯氏定氮法得,其计算公式:
DH=(N2-N1)(/N0-N1)×100%式中:N2为大豆蛋白酶酶解上清液中加10%TCA可溶性氮,mg;
1.4大豆蛋白的酶解反应
准确称取大豆分离蛋白,用缓冲液配成一定浓度的蛋白液,经处理,加入一定量的2709碱性蛋白酶,以10%NaOH调至一定pH值,精确反应一定时间(pH值变动范围±0.1),到达时间后,调节溶液pH值至4.0,并在
85℃水浴中维持20min,对酶进行灭活,然后迅速冷却至室温,在4000r/min离心20min,倾倒出上清液,记录总体积,取一部分上清液测蛋白质含量。
1.5浓缩
将水解液在旋转蒸发器上真空浓缩。由于水解液具有良好的起泡性,所以应严格控制浓缩液的温度、压力、浓度。
1.6冷冻干燥
将浓缩水解液经预冷,在CHRIST.ALPHA 1-4冻干机
冻干24h。
1.7大豆生物活性肽活性分析
N1为反应前大豆蛋白液中10%TCA可溶性氮,mg;N0为大豆蛋白中总氮,mg。

1.7.1抗氧化性
大豆蛋白中存在具有抗氧化活性物质[9]。邻苯三酚(PR)自氧化法是测定SOD(超氧化物歧化酶)活性的常
用方法。试验验证了大豆生物活性肽的生物抗氧化活性,即类SOD活性,采用3mL体系对各组分进行PR自氧
化的测定。空白管加重蒸水0.1mL,Tris-HCl缓冲液(pH8.2,0.1mol/L)2.8mL,25℃水浴保温10min,然后加入25℃预热的30mmol的PR 100mL混匀,开始记时,反应30s后,于320nm处作时间扫描,反应时间4min,空白最佳的自氧化速度控制为0.06,取肽粉20g溶于1mL重蒸水中,取0.1mL加入到缓冲液(pH8.2,0.1mol/L)2.8mL,25℃水浴保温10min,然后加入25℃预热的30mmol的PR 100mL混匀,30s后,于320nm处扫描,最后计算抑制率,用来评价供试品清除超氧阴离子自由基的活性。抑制率=(△A-△A0)/△A0×100%式中:△A、△A0分别表示加入和未加入抑制物时PR自氧化的速率,即每1min其光吸收的平均变化率。
1.7.2发酵试验[10]
培养基的配制:葡萄糖1g,KH2PO4 1g,NaCl 1g,含大豆分离蛋白或大豆生物活性肽液0.6g配制200mL发
酵液,培养液接种酵母后,在30℃、转速80r/min的恒温摇床上培养16h,培养后的酵母用10%硫酸溶液稀释10
倍,用血球计数器在显微镜下进行酵母菌计数。总菌数=a×25×10×1000×b=2.5×105a×b式中:a为每格中平均数;b为总液稀释倍数。
1.7.3降血脂试验[11]
取30只Wister大白鼠,按体重随机分成3组,大豆生物活性肽灌胃。第1、2组为给药组,其中第1组为高剂量组(1.0g/kg体重),第2组为低剂量组(0.5g/kg体重),第3组为空白组,给蒸馏水。动物在正常进食的情况下连续给药20d。待最后1次给药后2h,从大鼠眼眶静脉采血,分离血清,测定血清中胆固醇(CHO)、血清甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)的含量。spss进行统计学处理。
1.7.4小鼠负重游泳试验[10]
取昆明种小鼠30只(随机抽样)分成3组。进行游泳试验。水温22℃,试验前1d禁食;第1组给蒸馏水,第2组
给2%葡萄糖液,第3组给低剂量大豆生物活性肽液(0.5g/kg体重),第4组给高剂量(1.0g/kg体重)蛋白肽液。负重为体重的10%,将小鼠放入水池中游泳,记录至小鼠淹死时间。
2结果与讨论
2.1组成成分分析
水解产物经过分离、脱苦、脱色、脱盐、浓缩、冷冻干燥、粉碎之后所制得的大豆肽呈乳白色粉末,黏性较
大,易吸潮,较细腻,略呈苦味,且有淡淡的香味,其组成成分分析结果见表1。

 

2.2生理活性分析
2.2.1抗氧化性
试验得到氧化性抑制率为16.18%,大豆肽具有类SOD的功效。邻苯三酚在碱性条件下会发生自氧化反应,反应速率被抑制的大小显示超氧阴离子被清除作用的强弱。作为抗氧化剂,蛋白质类物质中最有前途的当属肽类[12]。肽类不仅在油溶体系中有良好的增效作用。如双肽对r-生育酚有增效作用,而且在水溶体系中、乳
化体系及干燥体系中也有较高的抗氧化活性。山口直彦等[13]发现大豆水解液有抗氧化性。其他学者[14-15]对蛋白质水解液和氨基酸的抗氧化性进行了研究。发现构成肽的氨基酸的种类、数量及氨基酸的排列顺序决定着肽的抗氧化能力。某些肽及蛋白质水解液可以降低油脂食品的自氧化速率与过氧化物的含量。其原因为捕捉金属离子或者是促进过氧化物的分解,可抑制多元酚氧化酶的活性,因而延缓食品在贮存过程中的褐变现象[16],将大豆蛋白水解肽与酚类抗氧化剂协同作用,可显示出一定的增效作用。所以,经过一定处理的大豆肽对于制备具有抗氧化性的化妆品,将是很好的添加剂。卢阳等研究发现在水解初期,抗氧化力随着DH的增加而增加。达到一定值后,又随着DH的增加而减少。表明抗氧化力可能与肽链的长度以及肽中的氨基酸排列顺序有关。大豆蛋白水解物中存在具有抗氧化性的活性肽,能抑制机体内自由基的大量积累,对提高清除机制起到一定的功效,从而能在一定程度上清除机体各种生理功能的障碍,延缓机体的衰老,减少各种老年性疾病的发生。
2.2.2发酵试验
大豆肽对酵母发酵的影响(表2)表明,大豆生物活性肽组相对于空白组增加了8.9倍,等同于蛋白质组,高
于蛋白胨组2.5倍。可见大豆肽具有促进发酵的作用。大豆多肽能促进乳酸菌、双歧杆菌、酵母菌、霉菌及其他菌类的增殖作用[7,17],有促进微生物生长发育和代谢作用,可以将其用于生产酸奶、干酪、醋、面包、酱油、火腿等食品中,提高生产效率,改善品质的稳定性、营养性及风味;还可以用于酶制剂的生产中。

 

2.2.3降血脂分析
大豆肽对大鼠血清的影响(表3)表明,高剂量给药对大鼠血清甘油三酯具有明显地降低作用,与对照组相比p<0.05,因而具有统计学意义。

 

以前的研究已有报道,大豆蛋白具有降低血清胆固醇的作用。大豆蛋白能减少高胆固醇患者血浆中LDL胆固醇,即使在正常胆固醇浓度情况下,可以不降低总胆固醇含量,但能改善LDL/HDL的比率。其作用机制认为是大豆蛋白质中含有的高分子组分能同胆汁酸结合,而使胆固醇下降。大豆蛋白降低胆固醇派生来的功
能是抑制动脉硬化。在最近的研究中发现大豆蛋白比酪蛋白能更有效地减少氧化胆固醇的消化吸收。大豆多肽是大豆蛋白质的水解产物,而大豆肽不仅具有这样的功能,而且效果更佳。大豆肽能阻碍肠道内胆固醇的再吸收,并能促使其排出体外。大豆生物活性肽能刺激甲状腺激素分泌促使胆固醇代谢生产胆汁酸。胆汁酸又被食物纤维所吸附排出体外,从而阻碍对胆固醇的吸收,起到降低胆固醇作用[18]。
大豆生物活性肽降低血清胆固醇还有以下特殊的优点:(1)对于胆固醇值正常的人没有降低胆固醇的作用。却使LDL/HDL朝着比例下降的方向转变。(2)对于胆固醇值高的人具有降低总胆固醇值功效。(3)胆固醇
值正常的人在食用高胆固醇含量的蛋、肉、动物内脏等食品时,也有防止血清胆固醇值升高的作用。(4)使总胆固醇中有害的LDL,VLDL值降低,但不会使有益的HDL值降低。因此可用来生产降低胆固醇、血压及预防其他心血管系统疾病的保健食品。

 

2.2.4抗疲劳分析
大豆生物活性肽具有抗疲劳的作用。为考察大豆生物活性肽是否具有使动物迅速恢复疲劳提高耐力的作用进行了小鼠游泳试验。结果(表4)表明,给大豆肽组的小鼠坚持游泳的时间长,高剂量组长于低剂量组。而给水组时间最短,统计学处理结果p<0.05,表明大豆生物活性肽具有使动物恢复疲劳及提高耐力的作用。
运动时体内热量的消耗4%~10%是由破坏蛋白质来提供的。而体内不储藏蛋白质且不能合成必需氨基酸,同时发生了蛋白质合成的抑制,及肌肉蛋白质降解、氨基酸氧化及葡萄糖异生作用的增加,导致体内蛋白质利用的增加。所以必须及时地从外部补充氨基酸,以免造成肌肉蛋白的负平衡而使肌肉疲劳。活性肽在肌肉组织中氧化脱氨,一方面生成相应的α-酮酸进入三羧酸而氧化供能;另一方面,脱下来的氨基与丙酮酸或谷氨酸偶联,促使丙氨酸和谷氨酸酰胺的形成,从而提供能量物质。在特殊的应急情况下,可直接向肌肉提供能源[19]。因此,运动前、中及后蛋白质的增加或补充,均可以补充体内蛋白质消耗。且由于肽易于吸收,能迅速利用。因此,抑制或缩短了体内“负N平衡”的作用,尤其是运动前、中。肽的添加还可减少肌蛋白降解,维持体内正常蛋白质合成,减轻或延缓由运动引发的其余生理方面改变,达到抗疲劳效果[20]。因此连续饮用大豆多肽的饮料可明显地增强运动员的体力、耐力,迅速消除疲劳,恢复体力。

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