纳他霉素分离技术的研究进展
2007-09-05 21:44:46   来源：本站原创   评论：0 点击：

纳他霉素(Natamycin)又名游链霉素,是一种天然的多烯大环内酯类抗生素,它可以专性地抑制酵母菌和霉菌[1]。1955年,Struyk等人在南非纳塔尔(Natal)的彼得马利兹堡(Pietermaritzburg)镇附近的土壤中分离到了Streptomyces natalensis,并从其发酵产物中首次分离到了纳他霉素[2]。现在,纳他霉素已经被广泛地应用到食品防腐以及治疗真菌引起的疾病上[3]。到目前为止,已经有30多个国家将其使用为一种天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂[4]。1997年,我国国标GB2760-96规定纳他霉素可作为食品防腐剂,其商品名为霉克(NatamycinTM)。目前,国内外对纳他霉素的发酵以及应用方面研究得比较多,但由于从微生物发酵液中分离纯化比较困难,尤其是在工业生产中,分离成本比较高,因此价格一直居高不下,从而也影响了它的应用范围。本文将在评述现有分离纯化工艺的基础上,分析这些方法应用到工业生产中的可行性,并提出当前需要解决的问题。
1纳他霉素的分离纯化
1.1纳他霉素的性质及其在发酵液中的存在状态
纳他霉素是一种乳白色的、无嗅无味的两性结晶状粉末[5],分子式为C33H47NO13,相对分子量为665.73。纳他霉素是一种含有一个酸性基团和一个碱性基团的两性物质,等电点为6.5,熔点为280℃。纳他霉素在水中和极性有机溶剂中的溶解度极低,不溶于非极性溶剂。纳他霉素在水中及一些低级醇中的溶解度是随着pH的升高或者降低而增加的,中性pH时溶解度最低,pH在4.5～9之间时最为稳定,极端pH时会导致迅速失活。纳他霉素的稳定性受pH、温度、光照、氧化剂以及重金属等条件的影响[5]。在大部分食品的pH范围内,纳他霉素十分稳定[6]。温度对纳他霉素几乎没有影响(在中性水溶液中)。纳他霉素在室温条件下是稳定的,50℃放置几天或100℃短时处理,其活性几乎无损失。120℃条件下加热不超过1h仍能保持纳他霉素的部分活性。工业产品一般存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中避光保存。由于纳他霉素在水中溶解度很低,因此在发酵液中主要以针状、圆盘状等晶体形式存在,它在发酵过程中逐渐形成,颗粒直径通常为0.5～20μm,也可观察到直径大于40μm的针状颗粒[7]。
1.2纳他霉素的分离提取
1.2.1吸附洗脱法早期的一篇英国专利GB846,933[8]
报道了一种吸附洗脱的方法来提取纳他霉素,是通过以下几个步骤完成的:a.先将发酵液的pH调到7,再加入硅藻土,然后过滤,用少量水洗涤滤饼,将洗涤后的水和滤液混合到一起,将pH调到7;b.在混合液中加入酸式硅酸镁(或者硅藻土、活性炭)以吸附纳他霉素,然后先用甲醇(或者丁醇、酸性丙酮、乙醇、丙醇、二甲基甲酰胺等)洗脱,再用含70%的甲醇水溶液洗脱。将两次的洗脱液混合,减压浓缩至原体积的1/50～1/30,将浓缩液保持在3～5℃,直到结晶完成。过滤并用冷水洗涤结晶,后用丙酮洗涤,最后干燥;c.将包括菌丝体在内的滤饼放入到其体积5倍的甲醇中均浆15min,然后将混合物过滤,剩余的固体仍用上述方法处理,然后将两次的滤液集合到一起,之后的处理方法与处理洗脱液的方法相同。这样就得到了粗制的纳他霉素,每次发酵的产量都包括滤液和滤饼这两部分。进一步提纯纳他霉素可以采用两种方法:一是将粗制的纳他霉素溶解在冰醋酸中,然后过滤,将滤液的pH用氨水调到4,使纳他霉素重新结晶。这时的晶体很难过滤,通常是采用离心技术,然后用水、丙酮和乙醚来洗涤,最后干燥;另一种方法是将其溶解在少量醋酸中,然后过滤,将滤液倒入10倍的水中,不停搅拌直到形成结晶,然后过滤,洗涤,干燥。用这种方法分离纳他霉素过程比较复杂,每个操作单元费用比较昂贵,这就必然会加大实际生产
中的成本。
1.2.2有机溶剂法美国专利US3,892,850[9]报道,将发酵液的pH调到10以使纳他霉素从菌丝体上脱离下来,过滤除去菌丝体,然后在滤液中加入正丁醇,将pH控制在3～10之间,可以用磷酸将其酸化,必要时可将形成的沉淀物提出。最后恒沸点蒸发,得到粗制的纳他霉素。之后,可以选择不同的有机溶剂,例如冰醋酸、吡啶、二甲基甲酰胺等进行进一步提纯。在这种方法中需要用到正丁醇,一方面,它的沸点为117℃,蒸发时需要耗费大量的热能,增加生产成本;另一方面,它的毒性很强,且有令人难以忍受的臭味,这些对生产都是不利的。
1.2.3盐析法Homer等[10]将纳他霉素从发酵液中盐析出来,然后用溶解分离蒸发沉淀的方法回收。他们先将发酵液在pH6.5～7.5时过滤,除去菌丝体,再用少量水洗涤菌丝体;将滤液和洗涤液集合起来,加入25%～36%(w/v)氯化钠(也可考虑其他无机盐),高浓度的氯化钠可将所有纳他霉素从发酵液中盐析出来;将盐溶液的pH用盐酸(或其他无机酸,例如磷酸)调到2.5～3.0,然后过滤,弃掉滤液,得到粗制的纳他霉素。再用少量碳酸氢钠、丙酮,或者二者的混合溶液洗涤粗制的纳他霉素以除去杂质和无活性的色素;将纳他霉素溶解在乙醇、甲醇或者二者的混合剂中,最后将有机溶剂蒸发喷雾干燥得到精制的纳他霉素。用这种方法得到的纳他霉素纯度为85%～95%,回收率为40%～70%。在用盐酸调盐溶液pH时,pH一度达到了2.5～3.0,此时纳他霉素很容易发生糖苷配基反应,形成海藻糖胺裂解产物,导致失活[11]。
1.2.4真空浓缩法稍晚一些的专利GB2,106,498[12]采用了丁醇提取真空浓缩的方法提取纳他霉素。将硅藻土作为助滤剂加入到发酵液中过滤,用氢氧化钠将滤液的pH调到8,接着用丁醇提取;将滤液真空浓缩至原体积的1/20,沉淀出来的白色粉末就是粗制的纳他霉素。在室温下减压过滤干燥,这种微黄的粉末MIC为1/1,500,000左右,而一般发酵后的发酵液的MIC为1/2000。这种方法中也用到了甲醇作为提取剂,另外真空浓缩至原体积的1/20,必定会耗费很大的热量,不适于工业生产。
1.2.5 pH法Millis等[13]采用了在低pH下用甲醇增
加纳他霉素的溶解,进而回收纳他霉素的方法。首先,他根据发酵液中纳他霉素的浓度通过过滤、离心或者真空蒸发的方法来进行浓缩,然后加入甲醇,并用盐酸将浓缩液的pH调到1.0～4.5之间以使纳他霉素溶解,再用过滤或离心的方法去除杂质,最后用氢氧化钠(或者氢氧化钾)将溶液的pH调至6.0～9.0,这样,就可以获得纯度为80%的纳他霉素。
Borden等[2]采用了以下几个步骤来回收纳他霉素:a.在50～70℃条件下加热发酵液,并用错流过滤除去发酵液中部分水分,使浓缩度达到10%～50%(W/V);b.用氢氧化钠(或者氢氧化钾等)溶液将发酵液的pH调到10～11,加入一定量的水溶性的有机溶剂(例如乙醇、丙醇、异丙醇等),使纳他霉素充分溶解;c.用错流过滤除去发酵液中不溶性的固体;d.用盐酸将发酵液的pH调至5.5～7.5,使纳他霉素充分沉淀下来。在提取过程中,为了提高纳他霉素的稳定性,可以加入一些抗氧化剂(例如抗坏血酸,BHA,BHT等)。用这种方法得到的产品纯度可达94%～99%,回收率达到40%～70%。这两种方法都用到了蒸发浓缩,会耗费很多的热能。另外,前一种方法中,将pH调到1.0～4.5时容易导致纳他霉素酸解失活。
1.2.6梯度离心法上述分离提取方法都需加入有机溶剂,并且由于纳他霉素无论是在水中还是低级醇中的溶解度都不高,因此都需要加入大量有机溶剂,这就导致回收成本增加以及环境污染等一系列问题。最新的专利US6,150,143[7]报道了一种不需要加有机溶剂的回收方法,主要是通过两个步骤完成的:a.用均浆法,高速剪切法,超声波技术,热处理,调pH,酶解法,表面活性剂处理,所有这些技术单独使用或联合作用,将生物质破碎成小颗粒,既要使生物质破碎充分完全,又要尽量避免纳他霉素受到破坏;
b.采用重力梯度离心技术,根据溶液中各种物质的直径和密度的不同,将纳他霉素分离出来。反复使用上述方法可进一步提纯,得到纯度为90%,产量为80%的纳他霉素。
这种方法虽然避免了使用有机溶剂,且产量和纯度较高,但无论是在破碎还是在梯度离心的过程中都对操作者有很高的要求,需要找到适合的操作点,另外,对设备的要求也很高,因此不适于工业生产操作。
2研究展望
2.1纳他霉素的溶解性和活性
对于纳他霉素的分离方法,目前主要还是集中在向发酵液中加入有机溶剂、调节pH以增大纳他霉
素的溶解,继而进一步回收,这就涉及到对纳他霉素
溶解性和活性的研究。在纳他霉素的溶解性方面,只
有泛泛的报道,未见针对某种溶剂或某种混合溶剂,
以及不同温度、pH、溶剂水比例等方面纳他霉素溶解
性的详细报道。而对纳他霉素的稳定性,有文献报道它受温度、pH、光照、氧化剂、金属离子等方面的影
响,但没有详细报道这些因素会对纳他霉素的活性造成怎样的损失。因此,对这些方面进行研究对纳他霉素的分离工艺和应用有着重要的指导意义。详细的数据支持,是确定合适的溶剂、合适的溶剂添加量以及其它分离条件的基础,同时,也是确定应用条件的基础。因此,有必要对这些因素进行研究。
2.2纳他霉素的生产成本
在纳他霉素的分离过程中,首先,为了减少有机溶剂加入的量就要浓缩发酵液,这步中常用到的就是真空蒸发,需要消耗大量的热能,增加生产成本。因此,需要找到一种更为节能的浓缩发酵液的方法;其次,有机溶剂的大量加入会导致生产成本的增加、回收问题,还会对环境造成污染,任何生产都不能以破坏环境为前提。所以,我们所选的有机溶剂,需是毒性小、价格适合又便于回收的;另外,纳他霉素的纯化过程也比较复杂,每多一级纯化就要导致成本的上升。因此,需针对不同的产品要求进行生产,减
少多级纯化的成本。
2.3纳他霉素的应用
目前,纳他霉素主要应用于食品防腐方面,虽然已有相关的国家标准,但仅限于对其用量及残留量的规定,而没有对其纯度品质的要求。另外,纳他霉素作为抗生素还被用于治疗真菌引起的疾病。我们知道,药品和食品的质量标准是不同的,对其纯度要求比食品更高。对这两种用途的不同标准直接导致生产成本的不同,因此我们有必要确立不同的纯度标准。此外,纳他霉素成品中一般含有赋形剂,这些赋形剂是否会对它的应用产生影响也是需要考虑的问题。总之,我们需要找到一种工艺简单、产量纯度高并且无污染的分离纯化方法,从而降低成本,使纳他霉素这种高效天然的抗生素得到更广泛的应用。