异亮氨酸对他克莫司发酵的影响
2007-09-19 20:03:44   来源：华东理工大学学报   评论：0 点击：

　　他克莫司(FK506)是一种新型二十三元大环内酯聚酮类免疫抑制剂。聚酮类化合物代谢途径中的基因特性已经表明了过程中有复合酶系统聚酮合成酶(Polyketide Sythases , PKSs)的参与[1]。PKSs通过类似脂肪酸合成机制催化一系列短链羧酸的酰基缩合反应。FK506属于非芳香环聚酮类化合物即由PKS-I催化其生物合成。在这个类型的PKS系统中通过乙酸、丙酸和丁酸的缩合构筑大环聚酮[2],由此可推断出FK506可能由这些短链脂肪酸及其CoA衍生物缩合成聚酮链进而形成内酯环。某些氨基酸的碳骨架在经过一系列循环过程可产生这些前体物质并能促进合成代谢中的酶活,从而影响产物的产量。文献报道曾以几种氨基酸作为惟一氮源并将这些氨基酸进行分类,第1类氨基酸氧化分解产生丙酰辅酶A;第2类氨基酸进入TCA循环,由此增加琥珀酸盐的量,而琥珀酸盐又可转化成甲基丙二酰辅酶A;第3类氨基酸新陈代谢产生乙酰基辅酶A,这些酰基辅酶被认为是内酯环形成的重要因素之一[3]。本文重点研究了对产物合成贡献最大的前体氨基酸对FK506发酵过程的影响,并通
过某些有机酸的变化推测可能的合成代谢途径。
1　材料与方法
1.1　菌株和培养基
他克莫司链霉菌由本实验室自备。斜面培养基:麦片50 g,蔗糖20 g,琼脂10 g,pH自然,去离子水定容至1 L,0.1 MPa湿热灭菌30 min。种子培养基:葡萄糖10 g,酵母粉5 g,甘油10g,玉米浆5 g,CaCO32 g,可溶性淀粉15 g, pH7.0,自来水定容至1 L,0.1 MPa湿热灭菌30 min。发酵培养基:葡萄糖10 g,酵母粉1 g,黄豆饼粉15 g,花生饼粉20 g,玉米淀粉20 g,K2HPO45 g,NaCl 2 g,自来水定容至1 L,pH7.5,0.1 MPa湿热灭菌30 min。
1.2　培养方法
他克莫司链霉菌接入斜面培养基28℃培养7 d后,接入250 mL装有种子培养基30 mL的三角瓶中,28℃、摇床转速225 r/min培养48 h左右,转接入250 mL装发酵培养基25 mL的三角瓶中,28℃,225 r/min摇床培养72 h。
1.3　测定方法
1.3.1　菌丝体生长量的测定　干重法:取10 mL发酵液,4 000r/min离心10 min,生理盐水洗涤2次,105℃烘至恒重称量。
1.3.2　FK506产量测定[4]　发酵液样品预处理:取发酵液2 mL,加入甲醇3 mL,加盖盖严(以防止甲醇挥发),振荡10 min,室温静置1 h,3 000 r/min,离心30 min后,取上清液放于4℃冰箱备用。HPLC条件:Waters HP1100高效液相色谱仪,色谱柱:Pheno-mex C18(4.6 mm×250 mm,5μm),流动相:V(1 g/L(H3PO4))∶V(乙腈)=32∶68。流速为1.0 mL/min,柱温50℃,检测波长205 nm。
1.3.3　有机酸测定(HPLC测定)　样品的预处理:发酵液倒入15 mL离心管中,10 000 r/min离心10min,取上清液,-20℃冰箱保存备用。高效液相色谱仪:Waters HP1100;色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq (4.6 mm×150 mm,5μm),流动相H3PO4(1 g/L),流速为0.6 mL/min,柱温35℃,检测波长210nm。
1.3.4　酶活测定　无细胞粗提液的制备:过滤收集菌体,分别用无菌蒸馏水和Tris-HCI缓冲液(pH8.0)各洗2次后,悬浮于20 mL 0.1 mol/L pH 8.0的Tris-HCl缓冲液(含0.1 mol/L DTT)中,冰浴中用超声波破碎(280 W,4 s×6 s,50次),离心(4℃,10 000r/min,30 min)后,取上清液备用。丙酰激酶活性测定和丙酰CoA合成酶活性测定见文献[5]。
1.4　实验方法
1.4.1　氨基酸的添加　8种必须氨基酸在发酵开始时加入到发酵培养基中,发酵结束后测定产量。
1.4.2　Ile最佳添加量的确定　对Ile最佳浓度进行选择,考察在不同浓度下FK506产量大小。
1.4.3　Ile添加时间的选择　确定Ile最佳添加浓度后,考察在发酵不同时间添加Ile对发酵产量的影响。
2　实验结果
2.1　发酵初期添加各种氨基酸对FK506发酵产量的影响
8种必需氨基酸,选择添加量为2.5 g/L,在发酵初期加入,以不添加氨基酸为对照。结果发现,在此添加量下,只有加入Ile、Arg的摇瓶产量明显高于对照,其他条件多少抑制了FK506合成,均比对照稍低(见表1)。

2.2　Ile添加量对FK506发酵产量的影响考察Ile不同的添加量对FK506产量的影响。结果表明,在所选择的浓度范围内,产量的变化不大(见表2)。
 

2.3　Ile最佳添加时间的确定经添加不同氨基酸实验,挑选出对FK506合成最有帮助的Ile及Ile浓度(2.5 g/L),然后分别在发酵开始12、24、36、48 h时添加Ile,结果发现,在发酵24 h添加效果最好(见表3)。

 

2.4　Ile对发酵过程中各基本代谢参数的影响
考察了添加Ile及对照在发酵过程中pH,菌体生长量(ρx),残糖(ρs)和效价的变化,结果如图1,2。
FK506产生菌的生长主要集中在发酵前24 h,之后进入次级代谢阶段,产物开始生成,72 h产量和菌量达到最大,添加Ile与对照相比,菌量的变化不大,而葡萄糖的含量有所下降,表明加入Ile后对菌体的生长影响不大,但促进了葡萄糖的分解代谢。说明添加Ile促进产量的增加与菌量无关,而有可能是由于葡萄糖的进一步分解利用形成各种利于产物合成的前体物质所导致的。
 

2.5　Ile对FK506发酵过程中有机酸的影响

三羧酸循环在微生物代谢中占有枢纽地位,氨基酸的代谢与三羧酸循环更是联系密切。为了考察Ile在FK506发酵过程中的作用,以及三羧酸循环通量的变化对FK506发酵的影响,本文测定了α-KG(α-酮戊二酸)、Suc(琥酸)、Pyr(丙酮酸)和Pro(丙酸)的时序变化,见图3。从图3可以看出,在发酵24 h添加Ile后,α-KG、Suc的浓度明显比不加Ile高,特别是α-KG在次级代谢后期,增幅较大。在不加Ile的发酵液中发酵36 h后就检测不到丙酸的存在,而添加Ile后丙酸浓度大幅度提高。但丙酮酸浓度则是在添加Ile后的60 h之前低于对照。36 h之后是产物合成的重要时期,几种重要有机酸的含量增加和降低可能为产物合成代谢途径提供了重要的信息。2.6　Ile对丙酰CoA合成酶和丙酰CoA激酶的影响PKS是聚酮类化合物合成的重要酶系,FK50属于非芳香环聚酮类化合物即由PKS-I催化其生
物合成的[5],每个碳链环的延伸是由一系列类似于脂肪酸合成的功能域催化的,该系统运行将若干丙酰CoA和甲基丙二酰CoA连续缩合形成FK50的聚酮部分,而丙酰CoA合成酶系统和丙酰激酶系统是催化形成酰基CoA的重要酶系。因此本实验测定了两酶活性的变化,结果见图4。从图中可以看出添加Ile的发酵液中丙酰CoA合成酶活性比对照高出很多,且第二个活力峰后移,集中在产物合成时期。但丙酰激酶活性在加与不加Ile情况下差别

3　讨　论
在FK506发酵过程中添加Ile,产量比对照提高了约59%,表明Ile能有效地促进FK506产生菌的次级代谢,从而显著提高了FK506的生物合成。添加Ile后,菌体生长量变化不大,而糖耗增大,表明加入Ile后并没有引起菌体过分生长,致使初级代谢阶段延长,而是通过代谢途径形成有助于产物合成或某些重要酶的前提物质,增加了产物量。用于FK506聚酮合成部分需要10个扩展单元:包括4个丙酰CoA,5个甲基丙二酰CoA和1个丙基丙酰CoA,它们连续地缩合到二氢环己烷羰基CoA(来自琥珀酸)上形成聚酮链。该物质是FK506合成的起始单元,最后连接到聚酮链上环化形成内酯环。丙酰CoA的合成途径有两条[6],一是通过丙酰CoA合成酶途径,二是通过丙酰激酶酰基磷酸转移酶偶联途径,促进两酶活力则有可能提高前体物质丙酰CoA的生成从而提高产物合成量。由两酶活性变化曲线可以看出,添加Ile后丙酰CoA合成酶第2个活力峰主要集中在产物合成高峰期,并且活力峰比对照高出许多,相对应产物FK506产量开始增加,而丙酰激酶的活力在加与不加Ile条件下变化不大。因此可以推测,丙酰CoAFK506合成的小分子物质,通过丙酰CoA合成酶途径生成,促进丙酰CoA合成酶活力是提高产物合成的重要途径和手段之一。从有机酸浓度变化趋势图中可以看出,在添加Ile后,α-酮戊二酸、琥珀酸,丙酸浓度明显增加。αKG可经三羧酸循环代谢生成琥珀酰CoA,进而转化成丙酰CoA和甲基丙二酰CoA,促进FK506内酯环的合成,琥珀酸也作为前体合成的重要物质,其浓度的显著提高可能促进了上面提到的FK506合成的起始单元。丙酸浓度的变化最为显著,从加入Ile后丙酸浓度就一直远远高于对照,而从FK50开始生成时,对照的丙酸浓度就趋近于零。丙酸浓度的增加也为丙酰CoA合成酶提供了大量的底物因此对应的时间里该酶的活力大幅增加,结合产物生成趋势、丙酸浓度和酶活力变化,猜测丙酸的低浓度可能是FK506合成提高的限制性因素。丙酮酸浓度的相对降低可能是由于Ile的加入促进了丙酮酸流向三羧酸循环,而由循环中间体琥珀酸CoA转向了生成丙酰CoA和甲基丙二酰CoA。由上述得出结论,第1类氨基酸Ile经由代谢途径形成丙酰CoA,增加了产物合成的前体物质,从而促进了产物合成。通过对其代谢流程的分析,可以寻找相似增加FK506合成小分子物质的有效成分,进一步提高FK506产量。