红曲多糖的提取与发酵工艺的优化
2008-10-16 12:52:47   来源:本站原创   评论:0 点击:

通过对三种常用红曲霉液体培养发酵产多糖的比较分析,选出红色红曲霉3.4701为高产菌。用正交法研究了不同条件对红曲霉生长影响,从中选出了红曲霉液体深层发酵的优化培养基:大米浆,NaNO3 0.15%,MgSO4·7H2O 0.15%,KH2PO4 0.244%,温度35℃。

 张建峰1 陈光1 周金萍2 孙文怡1
(1、吉林农业大学,长春,130118;2、辽源市卫生学校,辽源,136200)
hongyan197345@21cn.com
 
关键词:红曲霉,多糖,优化
1.前言
红曲是我国“药食同源”的典型代表,其药用价值在《本草纲目》、《兽医草本》中都有记载,具有功效:杀菌、防腐、解毒、消食、活血、健脾等[9]。红曲在发酵食品、食品色素、中药等领域有着广泛的应用,近年来由于合成色素的安全性受到严重挑战,天然食用色素日益受到重视,红曲色素的应用也日益广泛,随之红曲霉菌的次级代谢产物也成为研究焦点,如日本远藤章教授从红色红曲霉(Monascus ruber)中分离出一种还原酶抑制剂,命名为Monacolin K,有明显降低胆固醇和血糖的功能。此后引起全世界科学家对红曲霉的关注,日本、美国、比利时、法国、韩国等国众多学者专家对红曲的功能性、安全性、药用价值以及作用机理、分子结构进行了广泛而深入的研究,并取得了令人瞩目的成果。
真菌多糖存在于菌丝体、子实体及发酵液中,是由十个以上单糖以糖苷键连接而成的高分子多聚物,具有复杂的生物活性和功能[3],其中最主要的就是免疫调节活性。目前,真菌多糖已广泛应用于免疫性缺陷疾病、自身免疫及肿瘤疾病的临床治疗及医药领域的其他用途。近年来,真菌多糖的研究已成为分子生物学、医药学、食品科学等领域的研究热点之一[2]。经研究红曲霉具有产胞外多糖的能力,并且该多糖具有明显的生物学活性,利用红曲霉经培养能产生大量的菌丝体并且发酵液中含大量红曲多糖成分,经离心、醇沉产生的粗多糖和生物量在研究领域有着广泛的意义[8]。特别是在医药方面:在抗肿瘤方面, 红曲多糖抗肿瘤活性可能是通过其对免疫活动对宿主机能的影响而介导的,且水溶性多糖可能起着更重要的作用,而且具有抗肿瘤活性的多糖有最适分子量范围,分子量越大,抗肿瘤活性越强[4];调节心血管系统方面,有研究表明真菌多糖有明显的强心降压作用,对动脉粥样硬化有预防和治疗作用,其机理可能是由于提高了血浆胰岛素水平,加快了葡萄糖代谢,外组织和肝的葡萄糖利用加快,而达到降压作用; 在免疫调节[1] 方面,红曲多糖经口服或腹腔注射,能增强对蛋白质抗原延迟超过敏化; 此外还有其他药用效果,如:促进蛋白质和核酸的合成,神经系统的调节作用,对呼吸系统的作用,抗炎作用,对肌肤营养不良作用,放射保护作用,保肝解毒作用等。
目前红曲霉胞外多糖的研究非常少,中文期刊网和维普中仅有三篇相关文章,国外文献尚未检索到。本文研究旨在提高红曲多糖的产量,并准备继续研究其结构和组成。
2.材料与方法
2.1.材料
2.1.1.菌种 红色红曲霉3.4701、紫红曲霉3.570、普通红曲霉3.4810(中国科学院微生物研究所)
 
2.1.2.培养基
2.1.2.1.斜面培养基[7] 麦芽汁10°Bé,MgSO4·7H2O 0.15%,KH2PO4 0.244%,NaNO3 0.1%,琼脂1.5%,120℃灭菌30min.
2.1.2.2.摇瓶培养基[7] 大米浆,NaNO3 0.1%,MgSO4·7H2O 0.15%,KH2PO4 0.244%,固形物10%,pH值(自然pH=6.5),121℃灭菌30min.
2.2.主要仪器设备
离心机,回转式恒温调速摇床柜,旋转蒸发仪,电热鼓风干燥箱
2.3.多糖的提取方法
2.3.1.工艺流程
菌种→斜面培养→摇瓶培养→离心除杂→上清液→减压浓缩→醇沉→离心→沉淀→鼓风干燥→红曲粗多糖[7]
2.3.2.步骤及操作程序
2.3.2.1.菌体培养
2.3.2.1.1.初始培养 斜面32℃恒温培养4天
2.3.2.1.2.发酵培养 取经初始培养的三种红曲霉菌分别接入上述液体培养基中,250ml三角瓶中,加入50ml液体培养基,在32.5℃下,转速220r/min的旋转式摇床培养96h.
2.3.2.2.生物量的测定[8] 经摇床培养的菌体产生了大量的生物量,用八层纱布过滤后,得到的菌体在80℃下烘干12h,称量至恒重。清液待下一步提取多糖。
2.3.2.3.多糖醇沉
利用多糖溶于水或酸、碱、盐溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点,进行醇沉。将培养后的发酵液经离心去杂浓缩后倒入大型容器时除沉淀物,此时浓缩液的准确数量为浓缩后的数量减去除弃沉淀的数量,醇沉一般用普通酒精即可[2]。醇沉操作时,将应加入的酒精缓慢注入浓缩液中,并随加随搅至完全混合均匀,当混合液中酒精浓度为75%时,多糖成絮状物缓慢沉下,放入冰箱,醇沉8h,为了使混合液中酒精浓度达到75%原酒精加入量计算式:
[酒精加入量=75×浓缩液数量(ml)/(该酒精浓度分子数-75)]
2.3.2.4.离心、干燥[8]
经醇沉得多糖物质完全下沉至容器底部,可适当抽取上清液减少分离数量,但注意不要将多糖抽出,然后进行离心分离,转速3000r/min,5分钟停机,然后将多糖膏状物置入洁净搪瓷或玻璃器皿中电热鼓风干燥12h。
3.结果与讨论

3.1测定三种菌体的生物量及多糖产量结果

 
  
如图可见,3.4701 为产糖最优菌,因此选取 3.4701 作正交分析进行发酵条件优化。
.2.正交结果与数据分析
 3.2.1.正交试验 为确定其合适用量,进一步优化试验,分别选取温度为A因素,N
量为B因素,培养时间C因素
L9(34)正交试验[6],见表1   
3. [
 

  临界值F0.05(2,2)=19.00,F0.01(2,2)=99.00
**表示非常显著,*表示比较显著

3.3.无机元素的影响
无机元素有促进菌体生长及多糖合成的作用,经大量实验证明磷酸盐和Mg2+ 为红曲
生长的必需矿质元素,不同无机元素的加入对发酵液的pH值等内环境都有可能改变,为
察其协同作用,确定其合适用量进一步优化培养基组成,降低生产成本,分别选用
2PO4,MgSO4·7H2O为二因素(其它条件为正交实验中的最优组合)做平行试验,每个组
做样品 10 个然后取平均值[5]。对照两种因子对红曲霉的影响程度,表 3 结果表明,最
含量为MgSO4·7H2O 0.15%,KH2PO4 0.244%。
 

3.4.发酵优化条件检验 在250ml的三角瓶中加入优化组合的培养基 50ml,在 35℃,转速 220r/min 的旋转式
摇床上培养测多糖产量,表 4 表明最终优化后平均多糖产量达到 1.53g/L,比初始条件高出
25%
4 多糖
 

 4.小结
通过四组实验,包括:(1)最优菌筛选实验 ,得出红曲霉3.4701产胞外多糖的能力最强;(2)对发酵条件优化的正交实验,(3)对无机元素的含量测验的平行实验,对红曲霉的产多糖的结果分析,得出优化组合;(4)优化的发酵条件检验实验,得出结论: 红曲霉在经过斜面培养后 以大米浆为基础培养物(固形物10%), 加入NaNO3 0.15%,MgSO4·7H2O 0.15%, KH2PO4 0.244%,温度35"C ,220r/min 摇床培养96小时, 再经3000r/min离心5min, 8小时醇沉 电热鼓风干燥等 产多糖量高出初始条件25%,此实验分析结果对以后的生产、实验方面都具有数据参考价值。

本文旨在以低廉的基础培养基(大米浆)生产具有增强机体免疫力的红曲多糖,并优化了发酵条件,减少生产成本。后续准备对红曲霉3.4701进行诱变以期得到高产菌株,并进一步研究红曲多糖的组成、结构。
 
参 考 文 献 [1]赵顺起.我国食用菌的药用研究[J].生物技术,1993(3),9-11 [2]张惟杰.糖复合物生化研究技术(第二版)[M].浙江大学出版社,1999,96-101
4
 
[3]田军等.南京中医药大学学报.1998 14(4):217-218 [4]赵国华等.活性多糖的研究进展[J].食品与发酵工业,2001,(7):45-48 [5]EVELEIGH D E. Handbook of Microbiology[M].New York :Academic Press,1978,84-102 [6]孙东平.灵芝菌发酵培养基的优化及灵芝胞外多糖的分离纯化(J)中草药 2000(10)941-943
[7]陈
版,61,66,108,154
Zhang Jianfeng Chen Guang Zhou Jinping2 Sun Wenyi1
yieldi .
was se
the
3 MgSO4·7H2O
0.15%,KH2PO4 0.244
Keywords: Monascus spp. , polysaccharides ,optimization
运中.红曲色素、多糖与核酸的联合制备的研究[J].中国酿造,2002(1),26-27 [8]赵振锋.红曲霉发酵产胞外多糖工艺的优化。无锡轻工大学学报,2002.(3),289-291 [9]李时珍(明代).《本草纲目》,1998出
Extraction of Monascus Polysaccharides
and Optimization of Fermentation Condition
11
(1.Jilin agricultural University, Changchun, 130118, China;
2.Liaoyuan Hygiene school, Liaoyuan, 136200, China )
hongyan197345@21cn.com Abstract: Compared and analyzed the fermentation of three polysaccharides-yielding Monascus Stains, and confirmed Monascus ruber 3.4701 in the highest
ng strain. Optimal medium for deep layer fermentation of Monasus SPPlected and conditions for the isolation and purification of its
extracellular polysaccharide were studied for the purpose to develop production. Factors influencing the growth of Monasus SPP.on different media were studied by orthogonal experimental design. The best medium forfermentation was found to be composed of rice serosity, NaNO 0.15%,
%,temperature 35℃.
5

相关热词搜索:红曲霉 多糖 优化

上一篇:单子叶植物内生菌多糖抗肿瘤活性的研究
下一篇:内切酶法制取菊苣低聚果糖工艺条件的研究

分享到: 收藏
频道总排行
频道本月排行