红酵母产类胡萝卜素固态发酵工艺条件的研究
2007-03-23 22:11:13   来源：生　物　技　术   评论：0 点击：

　　类胡萝卜素(Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ)是一类呈黄色、橙红色或红色的多烯类化合物,除具有转化为维生素Ａ的生物活性外,还具有预防癌症和心血管疾病等多种生理功能[1]。目前,类胡萝卜素已被ＦＡＯ和ＷＨＯ等国际组织认定为Ａ类营养色素,并在50多个国家和地区获准作为营养、着色双重功用的食品添加剂与饲料添加剂。目前国内外利用微生物生产类胡萝卜素和β—胡萝卜素的微生物主要有红酵母和三孢布拉霉等。红酵母虽然发酵产率较低,但发酵工艺易于调控,属于我国饲料行业12种确认的饲用微生物(我国农业部第105号公告公布的允许使用的饲料添加剂品种目录中,饲料级微生物有12种)。三孢布拉霉发酵产率高,但发酵工艺较难调控,目前尚不属于饲用微生物,而且液态发酵普遍存在着生产工艺复杂、能耗高、环境污染大、成本高等缺点。与液体深层发酵(ＳｕｂｍｅｒｇｅｄＦｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ.ＳＭＦ)相比,固态发酵具有能耗低;培养基简单,多为便宜的天然物质;生产过程节水;操作简便易行等优点。如果发酵后的成熟醅子含水量低,可直接作为产品,提取成本低。特别是采用固态发酵工艺无废水废渣产生,因此不会造成二次污染[2]。从可持续发展的角度(即利用农副作物资源和环境保护)看,固态发酵具有很大的优势。从生态学和仿生学的观点,固态发酵法更适宜于微生物的代谢、生长、繁殖过程及生态[3]。研究利用饲用红酵母对农副产物进行固态发酵转化为增色饲料添加剂,在国内外都属首创,尚未见到同类报道。该研究对丰富市场上增色饲料添加剂的种类和提高禽蛋品质及风味等方面都具有极为重要的意义。本文研究了红酵母菌株Ｄ固态发酵最佳的培养基配方和发酵工艺条件,讨论发酵过程中多因素对生物转化量的影响。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1　实验材料

1.1.1.1菌种

红酵母菌株Ｄ(Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｓｐ.Ｄ)由湖北工业大学湖北省工业微生物重点实验室菌藏中心提供。

1.1.1.2　原料麸皮、豆粕、玉米、麦芽、黄豆、啤酒糟购自市场,其中豆粕、玉米、麦芽、黄豆粉碎后过20目筛。

1.1.2　试剂酵母膏(分析纯,中国医药(集团)上海化学试剂公司)葡萄糖(分析纯,上海化学试剂采购供应站分装厂),蛋白胨(ＢＲ,武汉市第二生物化学制药厂),石英砂(北京益利精细化学品有限公司)丙酮(分析纯,天津化学试剂有限公司),琼脂(中国上海爱建试剂厂),Ｋ2ＨＰＯ4(分析纯,上海化学试剂有限公司)ＣａＣｌ2(分析纯,武汉市中南化学试剂厂),ＦｅＳＯ4(分析纯,北京益利精细化学品有限公司)。

1.1.3　仪器ＰＱＸ多段人工气候箱,ＳＰＸ-150Ｂ-Ｚ型生化培养箱,ＴＧＬ-20台式高速冷冻离心机,ＬＤＺ-2自动平衡离心机,ＨＲ7638飞利浦食品加工机(用于物料的粉碎及混料),ＨＱ45Ｂ型恒温摇床,ｐＨ-25型酸度计,紫外分光光度计ＵＶ-2550(日本岛津)。

1.1.4　培养基

1.1.4.1　斜面培养基:麦芽汁培养基[4]。

1.1.4.2　种子培养基:葡萄糖2%,蛋白胨2%,酵母膏1%,自然ｐＨ,112℃灭菌30ｍｉｎ。

1.1.4.3　固态发酵培养基:发酵培养基配方详见表1、2、3、5。

1.2　方法

1.2.1　固态发酵:按比例称好培养基各组分,充分混匀,按设计的初始含水量加入盐溶液,混匀并搅拌至松散状,分装到一定体积的三角瓶中,配塞包扎,121℃灭菌30ｍｉｎ。将种子活化液(28℃摇瓶培养18ｈ,200ｒ ｍｉｎ),以一定的接种量接入固态发酵培养基中,28℃,恒湿箱中培养96ｈ(湿度与相应培养基的含水量相同)。

1.2.2　测定方法

1.2.2.1　生物量:干重法[5]。

1.2.2.2　色素产量及含量:将培养物50℃烘干,粉碎至40目,取1ｇ培养物,加入1ｇ石英砂,研磨10ｍｉｎ,加8ｍｌ丙酮提取30ｍｉｎ,冷冻离心(6000ｒ ｍｉｎ,15ｍｉｎ),将含有类胡萝卜素的丙酮提取液在紫外分光光度计中扫描,扫描图见图1,得到最大吸收波长484ｎｍ。将提取液适当稀释后用722型分光光度计在484ｎｍ处测定吸光度,参照Ｐ.Ｇｉｒａｒｄ[6]方法计算类胡萝卜素产量:

每克培养物的类胡罗卜产量(μｇ ｇ干基)=ＡλＭＡＸ×Ｄ×Ｖ0.16×Ｗ/(0.16*W)式中,ＡλＭＡＸ为类胡萝卜素最大波长处的吸光度;Ｄ为色素浸提液稀释倍数;Ｖ为浸提所用丙酮的总体积(ｍｌ);Ｗ为提取所用的发酵培养物重量(ｇ);0.16为胡萝卜素的摩尔消光系数。

2　结果与分析

2.1　培养基的优化

2.1.1　单因素试验在培养基中添加一定量的啤酒糟能较好的改善培养基的松散性,从而增大通气量,提高色素产量的积累[5]。现分别以玉米粉、麸皮、豆粕、麦芽粉、黄豆粉为培养基主要成分,每份培养基加5ｇ主料并添加1ｇ啤酒糟改善松散性。每种培养基设三个重复平行样,料液比1∶1,其中1ｇ ＬＫ2ＨＰＯ44ｍｌ,接种活化菌液2ｍｌ。

从表1的试验结果显示,红酵母色素产量在以蛋白质含量较高的豆粕、黄豆粉培养基中较以淀粉含量较高的麸皮、麦芽粉培养基中略高。在玉米粉中生物量、色素产量都较低,主要原因可能是由于培养基松散性较差,没有为菌体生长及生产色素提供足够的氧气。

2.1.2　多因素配比试验表1单因素试验结果表明,3号培养基的色素产量最大,且该培养基的松散性较好。多因素配比试验设计及结果见表2。

 注:每种培养基设3个重复平行样,料液比1∶1,其中1ｇ ＬＫ2ＨＰＯ44ｍｌ,接种活化菌液2ｍｌ。

由表2可见,多成分配比的培养基中色素产量都较单因素高,不同的配比中碳氮比、营养成分、生长因子不同,直接导致了生物量、色素产量、色素含量的差别。豆粕、黄豆粉中含有较多蛋白质,主要提供氮源,麸皮、麦芽粉中淀粉含量较高,主要提供碳源。其中8号试验中碳氮比最高,营养较全面,故菌体生物量、色素产量均最高。其次是5号和2号,为简化培养基成分,选取2号培养基啤酒糟∶豆粕∶麸皮=1∶4∶1,在其基础上对各成分的配比进行优化。实验结果见表3,得到培养基最优配比为:啤酒糟∶豆粕∶麸皮为1∶3∶2,其色素产量为13.99μｇ ｇ干基,比优化前的11.42μｇ ｇ干基提高了22.5%。

2.2　培养条件的优化

2.2.1　正交试验固态发酵是不溶性底物在足够的湿度但无游离水的状态下为微生物所发酵的过程。在此过程中,菌体细胞的生长及产物的形成都需要适宜的水分,因此控制培养基含水量是固态发酵过程中的重要环节之一[7]。基质的高含水量降低了基质的疏松度,阻止了氧气的传递,同时易受杂菌污染。相反,低含水量导致微生物生长不良。一般来说,氧气供应是固态发酵过程中必须解决的问题[8]。接种龄、无机盐等因素对细胞生长及色素产量也有不同程度的影响,故通过4因素4水平的正交试验Ｌ16(44)来确定含水量、三角瓶装量、接种龄、无机盐四个因素的最佳组合,在上述初步优化的培养基上,正交试验设计因素及水平见表4,实验结果见表5。

经极差分析可见,各因素对色素产量的影响次序为含水量>接种龄>装量>无机盐,其中含水量影响最大,最佳条件为含水量为60%,装量为6 150,接种龄为24ｈ,无机盐为0.5ｇ ＬＭｇＳＯ4,但是试验组中没有这一组合,故补做理论最佳组合,结果色素产量为14.2μｇ ｇ干基,与理论一致。

2.2.2　接种量对色素产量的影响一般液态发酵接种量在5%-10%之间,而固态发酵接种量较大,现选取4个水平探讨接种量对色素产量的影响。结果由图2可见,色素产量随接种量增大而增大,接近线性关系。

2.2.3　培养时间对色素产量的影响为揭示发酵全过程中各个因素之间的动态变化规律和相互关系及选择最佳发酵周期,在培养基啤酒糟∶豆粕∶麸皮=1∶3∶2中,装量为6 100,含水量为60%,接种龄为24ｈ,无机盐为0.5ｇ ＬＭｇＳＯ4,接种量为7%的条件下探讨色素产量、生物量、色素含量随培养时间的变化情况。一次配料接种进行发酵,定时随机重复取样进行分析测定,结果由图3可见,随着发酵的进行,细胞生物量、类胡萝卜素产量和含量均呈增加趋势,且均在24ｈ以前增长迅速,之后增长较缓慢,色素含量72ｈ之后基本上趋于平稳,108ｈ后明显下降。生物量、色素产量、色素含量在96ｈ分别达到最大值67.75ｍｇｄｒｙ-ｃｅｌｌ ｇ干基、9.88μｇ ｇ干基、145.80μｇ ｇｄｒｙ-ｃｅｌｌ。如用肉眼观察,水洗发酵培养物过滤液在24ｈ前呈浅黄色,24ｈ后逐渐转红,且越来越红,其ｐＨ初始值6.0在培养12ｈ为6.16,到24ｈ增至7.22,108ｈ时ｐＨ为7.46,之后又略有降低,可能是由菌体生长、自溶作用及产物氧化等所引起的。综合考虑各项指标,选定96ｈ为最佳发酵周期,过长或过短对生物量和产量均不利。

3　讨论目前国内外利用红酵母发酵生产类胡萝卜素都采用液态发酵,本文利用红酵母对农副产物进行固态发酵转化为增色饲料添加剂在国内外都属首创,尚未见到同类报道。在寻求红酵母菌株Ｄ固态发酵最佳的培养基配方和发酵工艺条件的研究中,通过单因素、多因素及因素配比试验得到初步优化的培养基为:啤酒糟∶豆粕∶麸皮=1∶3∶2。通过正交试验优化的培养条件是培养基含水量为60%,装量为6 150(即6ｇ干基按设计的初始含水量用盐溶液配好后装于150ｍｌ三角瓶中)。接种龄为24ｈ,无机盐为0.5ｇ ＬＭｇＳＯ4。接种量对色素产量影响较大,色素产量随接种量增大而增大,接近线性关系。随着发酵的进行,细胞生物量、类胡萝卜素产量和含量均逐渐增加,在96ｈ分别达到最大值67.75ｍｇｄｒｙ-ｃｅｌｌ ｇ干基、9.88μｇ ｇ干基、145.80μｇ ｇｄｒｙ-ｃｅｌｌ,培养基ｐＨ先增大后略有下降,故选定其最佳发酵周期为96ｈ。生物量是表征微生物生长状况的一项基本参数,它与代谢产物通常有一定的对应关系[9]。固态发酵中,菌体细胞与基质交织在一起,使生物量的测定非常困难。多数应用在液体发酵的测定方法难以在固态发酵中应用。本文测定生物量的方法也存在着一定误差,所测数据均比实际值偏小,有待进一步改进测定方法,提高结果准确度。此外,温度、湿度、初始ｐＨ、培养基筛分大小等因子对固态发酵产量的影响将有待进一步研究。