红霉素发酵工艺优化研究
2007-03-24 20:41:27   来源：生　物　工　程　学　报   评论：0 点击：

    红霉素属大环内脂类抗生素,它的抗菌谱和青霉素Ｇ相似,特别对革兰氏阳性细菌、抗酸杆菌、立克次氏体及大病毒有抗菌活性,是治疗耐药性金黄色葡萄球菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物,临床上可用于对青霉素过敏的患者。我国红霉素发酵水平与发达国家相比差距很大,属低水平重复操作,美国亚培公司年生产红霉素能力为2000ｔ,而我国红霉素年产量仅为200ｔ[1],国外发酵单位已达8000～12000ｕ/ｍＬ[2],生产利润极少,但由于红霉素衍生物的不断涌现及人们对红霉素药理作用的重新认识,尤其是在医药行业被誉为“重磅炸弹”的红霉素衍生物,克拉霉素、阿齐霉素的兴起,更加剧了母体红霉素的供需矛盾。本研究旨在利用具有抗噬特性的68#菌种作为研究对象对其工艺进行优化研究。不仅具有重要理论价值,而且具有明显的经济效益。

1　材料和方法

1 1　菌种采用西安制药厂68#抗噬菌株。

1 2　种子培养基培养基组成淀粉3 5ｇ,黄豆饼粉1 7ｇ,玉米浆0 9ｇ,花生饼粉1 5ｇ,葡萄糖3 5ｇ。蛋白胨1 3ｇ,硫酸铵0 6ｇ,磷酸二氢钾0 15ｇ,酵母粉0 5ｇ,用自来水定容到100ｍＬ。

1 3　培养条件

1 3 1　斜面孢子培养:用无菌操作将孢子悬浮液接于茄子瓶斜面培养基上,置37℃恒温室中培养6～7ｄ。

1 3 2　一级种子培养:培养基灭菌前ｐＨ调至6 8,32℃培养,将斜面孢子挖块接种于三角瓶内置于摇瓶机上振荡2ｄ。

1 3 3　二级种子培养:培养基灭菌前ｐＨ调至6 8,将培养2ｄ的一级种子以20%的接种量接种于无菌培养基中,32℃培养3ｄ,作为发酵培养种子。

1 3 4　发酵培养:将二级种子接种于无菌三角瓶或发酵罐中进行发酵培养,接种量为5%,34～31℃变温培养,摇瓶发酵周期为4ｄ,发酵罐发酵周期可持续到7ｄ。

1 4　发酵过程参数检测

1 4 1　还原糖和总糖的测定:取不同时期的培养液,用裴林法[3]测定其中的还原糖和总糖。

1 4 2　氨基氮的测定:采取不同时期的培养液,用甲醛法测定其中的氨基氮含量。

1 4 3　抗菌素测定方法:红霉素效价的测定:红霉素化学效价测定:采用硫酸水解法,即红霉素经硫酸水解后生成黄色物质,该物质于483ｎｍ处有极大吸收值。可用于定量测定。采取不同时期发酵液用无水醋酸丁酯在ｐＨ9 5时抽提,再用盐酸(0 1ｍｏｌ/Ｌ)抽提,所得盐酸抽提液加硫酸(8ｍｏｌ/Ｌ)水解比色;红霉素的生物测定。

1 4 4　ｐＨ测定:发酵罐发酵过程中ｐＨ测定由探头和Ｏｍｎｉ ＣｕｌｔｕｒｅＦｅｒｍｅｎｔｏｒ本身所带二次仪表自动显示,摇瓶培养过程中的ｐＨ测定由ｐＨ测定仪测定。

1 5　工艺参数优化方法

1 5 1　正交实验设计:通过文献和工厂经验,选取发酵配方中7种营养基质进行优化组合,为了避免种子批号、种龄,接种量和操作等偶然因素的干扰及减少实验次数,缩短实验时间,在文献[4]基础上选择Ｌ18(2×37)混合水平正交表。选用尚文耐特准则[5]对实验进行数据处理。

1 5 2　碳氮比优化:碳氮的合适配比,是菌体生长和良好代谢的至关重要的因素,合适的总糖与总氮源之比及还原糖与氮源之比是进行工艺优化的必要措施,通过改变不同配比考察其发酵水平,从而选取其优化配比。

1 5 3　捕集剂添加水平对红霉素发酵的影响:由于配方起始阶段的氮源盐强烈抑制[6～9]红霉素的生物合成。将对ＮＨ+4具有独特吸附和释放作用的磷钙和沸石按5∶1配成捕集剂与基础料一块加入,对其添加水平进行考察。

2　结果与讨论

2 1　摇瓶实验

2 1 1　正交实验结果:实验结果见图1。实验数据经处理后可以清楚地看出,在这7种营养成分中,对红霉素效价影响的程度:玉米浆>葡萄糖>黄豆饼粉>碳酸钙>淀粉>硫酸铵>磷酸二氢钾

2 1 2　快速碳源和慢速碳源对红霉素发酵的影响:葡萄糖可以产生碳分解代谢物阻遇效应,是红霉素生物合成的劣质碳源。但发酵初期较高浓度葡萄糖有利于菌丝体(孢子)萌发、生长和大量繁殖。在同样的发酵周期内,缩短了营养期(即红霉素链霉菌生长期)。因此葡萄糖和淀粉二者的配比是优化68#菌种工艺,提高红霉素发酵效价的一个重要措施。实验结果见图2ａ、2ｂ。从图2可以看出,快速碳源葡萄糖对慢速碳源淀粉的比值增加,红霉素效价经历了一个由低到高,再由高而低的过程,对该图线回归拟合,得:令ｄｙ/ｄｘ=0　解得ｘ=2.64当快速碳源和慢速碳源之比为2 64时,对红霉素的生物合成最为有利.

2 1 3　碳氮比对红霉素效价的影响:图3是还原糖与氮源之比,总糖与氮源之比取值的优化结果是80～120之间。图3示出,还原糖/氮维持在20时对红霉素产生极有利。2 1 4　无机氮源的影响:根据文献[5～8]报道,配方起始阶段过量的快速氮源或硝酸盐强烈地抑制红霉素的生物合成。培养基中残留无机氮源水平是红霉素生物合成的一个关键调节因素。从红霉素生物合成角度讲,无机氮源水平低些好,但是从菌丝体生长来看,过低的无机氮源不利于菌丝体的生长,因此,我们借助吸附缓释原理,把无机氮储藏在一个“库”中缓慢地释放。培养基中无机氮源浓度高时将其纳入“库”中,菌丝体生长需要时又可自如地吐出来。实验结果见表1。

表1示出:捕集剂添加浓度过小,对ＮＨ+4作用不大,添加浓度过大,ＮＨ+过多吸附,由于吸附和脱附过程均与ＮＨ+4所处微观环境有关,捕集剂的添加水平直接影响发酵液酸碱水平,因此必有一最佳值。由表可以看出,添加少量捕集剂,可使抗生素生物合成增长15%～24%以上。

表1示出:捕集剂添加浓度过小,对ＮＨ+4作用不大,添加浓度过大,ＮＨ+过多吸附,由于吸附和脱附过程均与ＮＨ+4所处微观环境有关,捕集剂的添加水平直接影响发酵液酸碱水平,因此必有一最佳值。由表可以看出,添加少量捕集剂,可使抗生素生物合成增长15%～24%以上。

2 2　发酵罐实验

2 2 1　添加捕集剂后ｐＨ变化情况:大生产实验与小试实验均表明,添加捕集剂后整个发酵过程中ｐＨ值变化比较平稳,ｐＨ变化在6 4～7 0之间,这对于抗生素生物合成极为有利,这也可能是捕集剂提高发酵水平的一个重要原因。

2 2 2　发酵过程中溶氧变化:本研究探索的优化工艺配方及其组合能较好地控制发酵过程中溶氧浓度,在进入分泌期后溶氧一直在30%左右,从而有效提高了红霉素发酵单位。这一方面是由于发酵液粘度趋于不变,菌体处于稳定生长期,菌体呼吸趋于恒定,因此在定量不变供气条件下,溶氧水平不变,并且优化工艺能使ＤＯ水平保持在溶氧限制水平以上。

3　结　论

对抗噬68#菌种的红霉素生物合成所需工艺条件进行研究,得出较为优化的工艺条件,提高了红霉素发酵水平,对照实验可高出工厂水平10%～25%。对无机氮源、碳氮比、快速氮源与慢速氮源的优化组合进行研究,得出快速碳源与慢速碳源之比为2 64时最有利于68#抗噬菌种的生物合成,其水平较对照水平提高13%。