高产类胡萝卜素酵母菌株ＬＲＹ 01发酵条件的优化研究
2007-04-05 18:07:53   来源：工业微生物   评论：0 点击：

　　类胡萝卜素是一类具有抗氧化、维生素Ａ前体等生理功能的多烯类化合物。作为药品,美国等国家已经将其用于维生素Ａ缺乏症、癌症及心血管病的防治;作为食品添加剂,类胡萝卜素已被国际权威机构ＦＡＯ和ＷＨＯ认定为Ａ类营养色素,并被广泛用做食品着色剂及保健食品功能因子[1]。　　国内外生产类胡萝卜素的方法主要有三种:化学合成法、提取法和微生物发酵法,其中最有发展前景的是微生物发酵法。三孢布拉霉和红酵母是目前研究较多的产类胡萝卜素的两种微生物。与三孢布拉霉相比,利用红酵母产类胡萝卜素,虽然类胡萝卜素含量较低,但是具有生产成本低、发酵周期短、发酵及提取工艺简单和产品质量稳定等优点。而且酵母菌体无毒,含有丰富的蛋白质和维生素,便于菌体的综合利用。因此,利用红酵母发酵生产类胡萝卜素具有广阔的应用价值和开发前景[2]。而筛选出高产类胡萝卜素的酵母菌株是实现工业化生产的关键。

1　材料与方法

1.1　菌株　　酵母ＬＲＹ 01,由沈阳化工学院生物工程教研室分离保藏。

1.2　培养基　　斜面培养基(%):葡萄糖5,酵母膏0.5,(ＮＨ4)2ＳＯ40.1,琼脂2,ｐＨ4.5。　　液体种子培养基(%):葡萄糖2,酵母膏0.5,(ＮＨ4)2ＳＯ40.1,ｐＨ4.5。　　发酵培养基(%):葡萄糖5,酵母膏0.5,(ＮＨ4)2ＳＯ40.1,ｐＨ4.5。

1.3　试剂　　核黄素母液(10-3ｍｏｌ/Ｌ):避光冰箱保存。　　番茄汁:选取颜色鲜红的番茄,匀浆,8层纱布过滤,3000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,取其上清液备用。注意现用现配。

1.4　液体种子的制备　　接1环活化的斜面菌种于装有50ｍＬ液体种子培养基的250ｍＬ三角瓶中,30℃、150ｒ/ｍｉｎ恒温振荡培养36ｈ。

1.5　摇瓶培养　　将制备好的液体种子按5%的接种量接入装有50ｍＬ发酵培养基的250ｍＬ三角瓶中,30℃、150ｒ/ｍｉｎ恒温振荡培养72ｈ。

1.6　发酵条件研究

1.6.1　碳源对类胡萝卜素产量的影响　　以酵母液体培养基为基础,碳源分别选用葡萄糖,麦芽糖,蔗糖和可溶性淀粉,培养基中其他成分不变。接种,培养,测定生物量和类胡萝卜素的产量。

1.6.2　氮源对类胡萝卜素产量的影响　　碳源为1.6.1所得,氮源分别取蛋白胨、硝酸钠、硫酸铵、尿素、麸皮汁,其他条件同上。

1.6.3　生长因子对类胡萝卜素产量的影响　　碳源、氮源分别为1.6.1和1.6.2所得,生长因子分别采用番茄汁、核黄素、豆油和番茄汁+核黄素,其他发酵条件同上。

1.6.4　通气量对类胡萝卜素产量的影响　　碳源、氮源及生长因子分别为上述实验所得,通过改变摇瓶培养基装量来考查通气量对菌株ＬＲＹ 01类胡萝卜素产量的影响。分别按10%,20%,30%,40%的装液量加入250ｍＬ三角瓶,其他条件同上。

1.6.5　正交实验　　在上述单因子实验的基础上,选取影响类胡萝卜素产量的主要因素进行Ｌ9(34)正交实验,进一步优化酵母ＬＲＹ 01产类胡萝卜素的液体培养条件,表头设计见表1。

1.7　生物量的测定　　将发酵液4000ｒ/ｍｉｎ离心20ｍｉｎ,弃上清液;菌体用蒸馏水洗涤2遍,4000ｒ/ｍｉｎ离心20ｍｉｎ,所得菌体置于100℃烘箱中烘至恒重,准确称重。1.8　类胡萝卜素含量的测定　　采用改进的酸热提取法,以丙酮为空白,用722-2000型可见光分光光度计在波长480ｎｍ下测量酵母菌体提取物的吸光度,计算细胞总类胡萝卜素含量[3]。2　结果与分析2.1　碳源对类胡萝卜素产量的影响　　不同碳源对菌株ＬＲＹ 01生物量和类胡萝卜素产量的影响见表2。

　　从上表可见,在所研究的4种碳源中,以葡萄糖作碳源时,菌株ＬＲＹ 01的生物量和类胡萝卜素产量均最大,分别可达6.70ｇ/Ｌ和167.50μｇ/ｇ。因此,采用葡萄糖作碳源进行其他实验。2.2　氮源对类胡萝卜素产量的影响　　氮源对菌株ＬＲＹ 01生物量和类胡萝卜素产量的影响见表3。

　　从上表可见,在所研究的5种氮源中,硫酸铵作氮源时,菌株ＬＲＹ 01的生物量和类胡萝卜素产量均最大,分别可达7.74ｇ/Ｌ和252.75μｇ/ｇ。因此,采用硫酸铵作氮源进行其他实验。2.3　生长因子对类胡萝卜素产量的影响　　根据涂俊铭对酵母菌产类胡萝卜素生长因子的研究结果[4],选取番茄汁、核黄素、豆油及番茄汁+核黄素等作为生长因子,研究其对菌株ＬＲＹ 01生物量和类胡萝卜素产量的影响,结果见表4。

　　从表4可以看出,所研究的4种生长因子均对菌株ＬＲＹ 01的生长和类胡萝卜素的合成有促进作用。利用核黄素作生长因子时,菌株ＬＲＹ 01的生物量和类胡萝卜素产量均最大,分别可达14.70ｇ/Ｌ和1014.38μｇ/ｇ。　　各种生长因子对酵母生长和类胡萝卜素合成的促进机理尚未研究透彻。根据资料分析,豆油在类胡萝卜素生物合成中起氧传递的作用,还与菌体的脂类代谢有关,可以加快菌体生长。番茄汁中含有的番茄红素是类胡萝卜素生物合成的前体物质,因而有利于菌体中类胡萝卜素产量的提高。核黄素对类胡萝卜素合成促进作用的机理可能在于核黄素可调节酵母代谢过程中酶的活性。因为核黄素在细胞中能以磷酸脂的形式结合形成两种辅酶,即黄素单核苷(ＦＭＮ)和黄素腺嘌呤二核苷酸(ＦＡＤ)。这两种辅酶能作为若干种酶系统的辅基。所涉及的酶系统可能是类胡萝卜素合成途径中的酶[5,6]。2.4　通气量对类胡萝卜素产量的影响　　当摇瓶装液量分别为10%、20%、30%、40%时,菌株ＬＲＹ 01发酵72ｈ的生物量和类胡萝卜素产量见表5。　　从上表可以看出,10%的装液量是适宜菌株ＬＲＹ 01液体培养的最佳装液量。在此条件下,菌株ＬＲＹ 01液体培养的生物量和类胡萝卜素产量均最大,分别可达6.74ｇ/Ｌ和982.50μｇ/ｇ。说明菌株ＬＲＹ 01的生长及类胡萝卜素合成均需要充足的氧气供应。

2.5　正交实验　　在单因子实验的基础上,选取影响菌株ＬＲＹ 01生物量和类胡萝卜素产量的主要因素碳源、氮源和生长因子进行Ｌ9(34)正交实验,进一步优化该菌株产类胡萝卜素的液体培养基配方和培养条件,结果见表6。

　　由表6可以看出,此正交实验所考察的3个因素均对菌株ＬＲＹ 01的液态发酵的生物量和类胡萝卜素产量有影响,其中氮源是主要影响因素。无论以生物量还是以类胡萝卜素产量作为指标,所考察的3个因素组合均以Ａ1Ｂ2Ｃ1为好,即葡萄糖取1水平,硫酸铵取2水平,核黄素取1水平。　　综合分析单因子实验和正交实验结果,可以得出菌株ＬＲＹ 01液态发酵的最佳培养基配方和培养条件为:葡萄糖40ｇ/Ｌ,(ＮＨ4)2ＳＯ41.0ｇ/Ｌ,核黄素0.5ｍＬ/Ｌ,酵母膏0.5ｇ/Ｌ,初始ｐＨ4.5,摇瓶装液量为10%。

　　通过3次验证实验表明,在上述优化条件下,菌株ＬＲＹ 01经摇瓶振荡培养72ｈ的生物量和类胡萝卜素产量由优化前的6.78ｇ/Ｌ和364.52μｇ/ｇ分别提高到16.19ｇ/Ｌ和1000.06μｇ/ｇ。该菌株类胡萝卜素的产量高于王岁楼的334.8μｇ/ｇ、刘月英的492.7μｇ/ｇ、Ｆｒｅｎｇｏｖａ的421μｇ/ｇ和Ｂｕｚｚｉｎｉ的630μｇ/ｇ,仅略低于仓一华的1359.7μｇ/ｇ[7～12]。由于菌株ＬＲＹ 01是从自然界分离的野生菌株,通过诱变育种的方法有可能进一步提高其类胡萝卜素产量。3　结　论3.1　单因子实验结果表明,碳源、氮源和生长因子种类及通气量对菌株ＬＲＹ 01液态发酵的生物量和类胡萝卜素产量有影响。3.2　通过Ｌ9(34)正交实验,得到了菌株ＬＲＹ 01液态发酵的最佳培养基配方及发酵条件:葡萄糖40ｇ/Ｌ,(ＮＨ4)2ＳＯ41.0ｇ/Ｌ,核黄素0.5ｍＬ/Ｌ,酵母膏0.5ｇ/Ｌ,初始ｐＨ4.5,摇瓶装液量为10%。菌株ＬＲＹ 01在此条件下摇瓶培养72ｈ的生物量为16.19ｇ/Ｌ,类胡萝卜素的产量为1000.06μｇ/ｇ。