环境因素和培养条件对类胡萝卜素表达的影响
2007-03-27 20:49:22   来源：上海华谊生物技术有限公司   评论：0 点击：

    类胡萝卜素是最常见的自然界中萜类色素。由于它们分布广泛，并且具有多样功能和特殊性质，引起了很多研究领域的兴趣。如流行病学的实验证据表明膳食中的类胡萝卜素阻止很多疾病的发生。类胡萝卜素作为一种强还原剂，可以消除体内的自由基，而自由基被证明是很多疾病初始发病的原因，诸如动脉硬化、白内障、多硬化症，甚至癌症[1]。尽管可以从自然界提取和化学合成的手段获取，但是由于成本和产品性质的原因。目前研究的主要关注点是通过微生物培养来获取类胡萝卜素。微生物根据对环境刺激信号的响应，能够在体内积累几种类胡萝卜素。类胡萝卜素作为光合色素组成成分之一，不仅可捕获400~550nm波长范围内的光能，并将捕获的光能传递给微生物叶绿素分子，而且还能猝灭叶绿素所产生的荧光，参与非辐射能量的耗散，即参与非化学猝灭过程。此外，它可通过与自由基的反应或通过与自由基链反应而清除自由基形成无害物质，在微生物体内发挥重要的生理功能[2]。

    利用微生物来生产类胡萝卜素在几十年前就已经开展研究，如筛选得到β-胡萝卜素的真菌———三孢布拉霉（Blakesleatrispora）。但是由于成本的劣势，这种方式又逐渐被化学合成法取代[3]。然而目前，由于公众对于“化学合成食品添加剂”的恐惧，从微生物中提取类胡萝卜素又得到了大家的重视。这些微生物包括微藻、真菌和细菌，但是只有很少一部分实现了商业化生产[4]。

   因此提高类胡萝卜素生产效率是目前的主要研究热点。除了培养条件，类胡萝卜素的生物合成受到其合成酶系的活力，以及在代谢过程中碳代谢流的影响。从理论上讲通过分子手段提高这些酶的活力，可以得到高产的菌株。目前也有一些工作是通过重组基因工程手段改造易培养菌的代谢网络，从而能够使这些非天然类胡萝卜素产生者可以生产类胡萝卜素，包括对假丝酵母、大肠杆菌、酿酒酵母、运动发酵单胞菌等的研究。但是由于缺乏必要的前体，这些菌株的类胡萝卜素积累量都很有限[5-7]。为了以简单的方式获取有成本优势的类胡萝卜素生产过程，研究者对内源产生类胡萝卜素的菌株培养开展了大量工作，发现添加一些刺激物加到培养基中，或者控制外部环境条件，可以达到很好的效果。

1类胡萝卜素的合成途径

外源环境的条件变化就是通过对类胡萝卜素合成过程中的酶量和酶活显著影响，从而影响到整个类胡萝卜素的生产。需要对类胡萝卜素的合成途径作简要阐述。类胡萝卜素生物合成途径通常包括三步：（1）将乙酰CoA转变为3-羟基-3-甲基戊二酰CoAHMG-CoA），然后HMG-CoA被转化为C6化合物———甲羟戊酸（MVA），MVA磷酸化后，经脱羧反应生成异戊二烯焦磷酸（IPP）。（2）从异戊烯焦磷酸经不同的途径可分别形成各种类萜终产物。IPP异构化为二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)后通过不同的异戊烯基转移酶用IPP分子连续1-4缩合，IPP的C-4与丙烯基辅底物DMAPP的C-1间形成碳键。然后DMAPP与3分子IPP缩合，形成牻牛儿基焦磷酸（GGPP），GGPP在八羟番茄红素合成酶的作用下形成了第一个无色的类胡萝卜素———八羟番茄红素，八羟番茄红素经过连续脱氢，形成番茄红素。（3）番茄红素是类胡萝卜素合成代谢的关键节点：一条路线是番茄红素在β-环化酶作用下产生β-胡萝卜素；另一条是在β-环化酶和ε-环化酶的作用下生成了α-胡萝卜素。从八羟番茄红素合成的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素都没有氧原子，统称为胡萝卜素。当胡萝卜素分子中引入羟基、甲氧基、酯键等之后形成结构更为复杂的含氧衍生物，这些衍生物被称作叶黄素。其中绝大多数的叶黄素都是由β-胡萝卜素转化而来，诸如隐黄质、玉米黄素、环氧玉米黄素、虾青素、角黄素、辣椒红素和辣椒玉红素等。细菌、真菌和藻类的合成途径在某些阶段、某些酶系和某些代谢中间产物有所不同，但是总体合成过程是基本相同的[8]。

2环境因素和培养条件对类胡萝卜素表达的影响

2.1光照的影响根据已有报道，光照对藻类、真菌和细菌的类胡萝卜素积累和生产都有促进作用。但是不同的微生物对光照强度和照射方式的要求都有较大不同。无论是增加还是减少光照时间或者改变光照强度以引起类胡萝卜素产量的提高，只要是以下两个方面，第一是对单位体积产率（mg/L）的提高，直接与提高微生物的生长水平有关，也就是说，光照在微生物生产中起到了刺激作用；第二是提高单位质量的细胞产率（mg/g），与类胡萝卜素合成酶的酶量和活性相关。对于光自养微生物杜氏藻———β-胡萝卜素生产藻，生产过程就需要高强度的光照，同时培养过程需要有高盐压力和营养限制。在一些情况下，只有无机和有机刺激物存在时，光强度变化才可以起到关键作用。当光强度从50提高到1250μmolm-2s-1，杜氏盐藻β-胡萝卜素积累量逐渐增加。当提高光强度从50~400μmolm-2s-1，雨生红藻生产虾青素的浓度显示显著提高[9]。在一些生产例子中，光照诱导的高产作用可以被活性氧(Reactiveoxygenspecies，ROS)代替，因为光照增加的最终结果是产生了更多的活性氧分子，它可能刺激类胡萝卜素的产生。在光照的情况下，活性氧和类胡萝卜素表达量之间的关系根据现有的研究结果还不明朗[10]。

Steinbrenner和Linder报道在雨生红藻中，当培养基中添加乙酸钠、铁盐后，增加光强，八羟番茄红素合成酶和类胡萝卜素合成酶的酶活增加[11]。在对衣藻的研究结果发现，八羟番茄红素合成酶和八羟番茄红素去饱和酶的活性也被提高[12]。有研究报道当光强从184提高到460μmolm-2s-1，叶黄素产量提高了近40%，但是进一步提高光强引起积累量的下降[13]。当把HMG-CoA还原酶的抑制剂洛伐他汀加入到培养基中，可以看到光诱导类胡萝卜素合成完全被抑制。如果要完全阻遏类胡萝卜素的生产，对洛伐他汀的需求量与光照的量相对应。如果在同样条件中补加足够量的甲羟戊酸，这种抑制作用可以被完全解除[14]。以上研究结果表明，在光照的诱导下，不同微生物中有多种酶量和酶活受到调控，从而影响类胡萝卜素的产量。

2.2温度的影响温度是影响到生物的生长和增值的最重要环境因素之一。它可以引起生物合成过程中很多变化，对温度的某些改变可以诱导类胡萝卜素的合成。温度变化控制类胡萝卜素合成的酶浓度，而酶浓度的变化最终控制着微生物表达类胡萝卜素的水平[15]。在商业化生产类胡萝卜素的过程中，控制温度以控制藻类生长，从而更好地生产类胡萝卜素。如当杜氏藻的培养温度从34℃降至17℃，α-胡萝卜素的单位细胞表达量提高了7.5倍，但是单位体积产量最高的最优温度是24~29℃。在仅仅降低温度的过程中，唯一得到提高的是α-胡萝卜素的产量。同时显示α-胡萝卜素和温度呈反比关系，而与光强度没有关系。但是对于β-胡萝卜素的产量而言，仅仅在低温的条件下，产量没有提高。只有当低温（19℃）和高光强的条件同时具备时，β-胡萝卜素的产量才有明显提高，原因可能是生长分裂在光照下和低温条件下有延迟现象。而生长延迟可以很明显地提高β-胡萝卜素产量[16]。在红酵母的例子中，β-胡萝卜素产量在低温下提高的比例更高。在30℃培养Rhodotorulaglutinis,β-胡萝卜素的单位体积产率为125mg/L，占类胡萝卜素总量的66%，培养时间72h。而在20℃，产率为250mg/L，占类胡萝卜素总量的92%。试验表明在对数后期，对30℃培养物进行光照，可以提高产率58%，然而同样的操作对于20℃的培养物就没有相应的提高。对于低温下β-胡萝卜素产量提高的解释如下：γ-胡萝卜素是类胡萝卜素合成中的一个分支，而在低温下γ-胡萝卜素合成需要的脱羧酶和脱氢酶活力远远低于β-胡萝卜素的合成酶。代谢流向β-胡萝卜素的方向迁移。在本试验中，光照可以提高HMG-CoA还原酶的活力，它直接关系到甲羟戊酸的量，从而影响到β-胡萝卜素的产率[17]。如果将红发夫酵母在4℃时培养，类胡萝卜素总量减少了50%。但是培养基中添加二甲苯和烟碱后，它能够将β-胡萝卜素转化为虾青素[18]。总体而言，低温时微生物从环境中摄取营养的速率下降，同时代谢活动减弱，如蛋白合成速率也下降，生物膜功能被干扰。而类胡萝卜素量的增加和脂类的不饱和化都是对低温时生物膜功能减弱的补偿。

2.3化学添加物化学添加剂能够影响很多微生物类胡萝卜素的产生情况，包括萜烯、紫罗兰酮、胺、生物碱、金属离子和抗生素等。例如，环化酶抑制剂2-(4-氯苯硫)三乙胺（CPTA）刺激番茄红素的积累伴随γ-胡萝卜素量的提高。而把细胞用无CPTA水洗涤后，β-胡萝卜素又能够被再次合成，并且γ-胡萝卜素和番茄红素的量减少[19]。番茄红素作为β-胡萝卜素的前体，所以在布拉克须霉中积累了高浓度前体后，β-胡萝卜素产量提高75%。用添加CPTA（100mg/L），二乙胺（1000mg/L）到培养基中也能够提高番茄红素的积累量。其他类似的结果如嘧啶和咪唑也能提高三孢布拉霉和布拉克须霉中番茄红素的量，因为这些添加物都是环化酶的抑制剂[20]。如藜芦醚是八羟番茄红素合成的抑制剂，补加藜芦醚(1g/L)，可以提高三孢布拉霉β-胡萝卜素产量，但是不同的研究者报道差距很大，有报道提高30倍的，也有报道仅仅微量提高的[21~22]。总体而言，这些化学抑制剂主要用于类胡萝卜素合成机理研究，而不是用于大规模生产β-胡萝卜素和番茄红素。Dandekar对可用于三孢布拉霉的化学添加剂作了总结。大多数化学添加剂都与三孢酸、维生素A、脱落酸、β-紫罗兰酮和α-紫罗兰酮类似，有共有的三甲基环己环，所有这些添加剂都报道在真菌中起刺激作用[23]。尽管这些化学添加剂的最大刺激作用基本一致，但是不同菌株所需要的添加剂用量和作用浓度还是有很大差距。其中结构中的短链和环上的酮基是发挥其生物功能的关键。补加β-紫罗兰酮(150μg/mL)和维生素A(150μg/mL)能够提高布拉克须霉胡萝卜素产量。有推测认为是维生素A直接转化为β-胡萝卜素，但是放射性实验排除了这种可能性[24]。补加抗生素也可以刺激类胡萝卜素生产，如在三孢布拉霉生长24h后补加青霉素（1mg/L），能够提高50%产量，并且不影响蛋白和糖的合成。可能是青霉素刺激了异戊二烯的合成，因为补青霉素后，甲羟戊酸激酶活性提高了一倍[25]。微生物的整个生命过程都有金属离子参与。钾离子和镁离子是微生物体内的常量离子，钠离子、钙离子和锌离子也是必须的离子。这些阳离子在微生物整个代谢活动中都有重要作用[26]。雨生红藻生产虾青素，补加铁盐可以增加产量，原因是产生了自由基，它刺激产生类胡萝卜素。如果有铁螯合剂存在，铁盐就失去了诱导高表达虾青素的能力。使用铁盐可以在一些情况下替代光照，以降低成本[27]。在红发夫酵母培养过程中添加一些重金属离子，如镧离子、铈离子和钕离子能够提高虾青素产量约37%。三孢布拉霉培养中，添加微量的铜离子、铁离子和锰离子（0.01μmol），能够显著提高β-胡萝卜素的产量，原因是这些离子的添加刺激了三孢酸的表达，三孢酸解除了对甲羟戊酸激酶的抑制，甲羟戊酸激酶在类胡萝卜素生产中对前体积累起到了重要作用[28]。三羧酸循环的中间产物在有氧代谢中发挥着重要作用，形成微生物类胡萝卜素的碳架。首先是柠檬酸和苹果酸作为刺激生长物被研究，在培养基中添加28mM或者更高的量，能够刺激类胡萝卜素的产生。但是，这种增长伴随着蛋白合成速率的下降，意味着蛋白合成速率在类胡萝卜素表达中有重要作用。对多数TCA中间产物而言，他们能够显著提高类胡萝卜素单位体积产量。可能是较强的呼吸作用和TCA循环活性能够产生较多的自由基，从而提高类胡萝卜素的产率[29]。添加有机溶剂，如乙醇、甲醇、异丙醇和乙二醇在培养基中，能够刺激微生物生产类胡萝卜素。Gu等研究发现0.2%的乙醇可以提高红发夫酵母类胡萝卜素的表达[30]。乙醇代谢刺激了HMG-CoA还原酶的活性，从而提高了类胡萝卜素的生产，而且红发夫酵母转入HMG-CoA还原酶和合成酶后，类胡萝卜素产量明显提高[31]。

3结论

目前，类胡萝卜素的主要需求还是由化学合成物供应，但是化学合成过程的副产物对消费者能够造成一些不良反应，这一点也被逐渐证明。因此，从微生物来源中生产的天然类胡萝卜素是目前的热点，而限制通过微生物培养提取类胡萝卜素产业化的瓶颈主要是成本问题。本综述通过调节外部培养环境和添加化学刺激物以提高类胡萝卜素产量的方法，这些方法操作都比较简单易行，不会增加放大培养后的控制成本。但科学研究结果多是从某一个因素出发，在实际的生产过程中，需要通过统计学的方法设计一个最优的控制条件和补加策略以提高产能水平。随着科技的发展，很多化学合成品的副作用逐日显现，社会对天然添加剂的关注也与日俱增。而类胡萝卜素的药理功能的研究也愈来愈深入，其功效逐步得到了大众的认知。可以想象，未来类胡萝卜素的市场会越来越大，微生物生产类胡萝卜素有巨大的开发潜力。