酶制剂的酶活测定方法及影响因素
2010-10-23 09:32:07 来源:湖南农业大学 生物科学技术学院 评论:0 点击:
随着我国畜牧业的发展和生物工程技术的不断进步,酶制剂在饲料工业中的应用越来越普遍。由于酶制剂能够消除饲料中的某些抗营养因子的负面作用,提高饲料消化率,改善动物生产性能,降低生产成本,因此日益受到饲料界的重视。但是,由于酶制剂来源比较复杂、分子结构不明确,分离提纯困难等多种原因,使这类产品有国家标准的不多,即使有国标也存在一些问题。给广大养殖用户和生产企业带来很大不便。本文简要介绍一下常用的酶活测定方法及测定过程的影响因素,仅供广大饲料工作者提供参考。
1 酶制剂的定义及分类
所谓的酶制剂就是通过产酶微生物发酵工程或含酶的动、植物组织提取技术生产加工而成,具有一种或多种底物清楚的酶催化活性,有助于改善动物对饲料营养成分的消化、吸收等,并有功效的生物学评定依据,符合安全性要求,作饲料添加剂用的酶制剂产品(NY/T 722-2003)。工业上应用的酶制剂大多为水解酶,按作用底物的不同,可分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。按动物体内是否分泌,分为消化酶和非消化酶两大类。消化酶指动物自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等,在幼龄动物或特殊生理阶段时,动物也存在消化酶分泌不足需要外源供给的情况。非消化酶是指动物自身不能够分泌或很少分泌,必须由外源供给的酶,这类酶能消化动物自身不能消化的物质或降解一些抗营养因子,主要有植酸酶、木聚糖酶、果胶酶、葡聚糖酶、纤维素酶等。
2 常见的酶活测定方法
通常酶制剂活性的检测是采用实验室分析手段来进行评价,它可以用来筛选优质酶制剂、确定复合酶制剂的最佳组方及确定产品的最佳添加量等,酶制剂实验室评价技术是目前饲料厂家应用最为广泛的一种方法。其操作相对简单,检测所用时间短,便于生产实践应用。酶活测定结果虽不能完全反映酶的使用效果,但通过检测至少可以避免使用劣质的酶制剂。我国饲料工业标准中已经确立了饲用植酸酶(GB/T 18634)、纤维素酶(NY/T912)、β-葡聚糖酶(NY/T 911)的测定方法。另外,许多企事业单位为了生产研究的需要也制定了很多用于各种酶制剂活力的测定方法。目前测定酶制剂活性的方法主要有:
2.1 比色法
比色法是以反应生成有色化合物的显色反应为基础,通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法,根据原理不同可分为还原糖法和色原底物法。
2.2 黏度法
这种方法是根据酶能够降低一定浓度的标准底物(控制pH值、温度等条件)的黏度的能力来确定酶的活性。利用的底物主要有化学合成的底物(如CMC 用于纤维素酶的测定) 和自然提取的底物(如小麦阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的测定)。测定的酶的活性值是通过与同时测定的标准酶活性的比较,来确定酶的活性。该法可用于木聚糖酶、β-甘露聚糖酶、β-葡聚糖酶等酶活测定。这种方法的特点是通过降低底物的粘度来反映酶的活性,这也正是酶在体内起作用的重要特征。该法虽然灵敏度较高,但重现性差,操作复杂费时,应用难于普及。
2.3 免疫学法
用于酶活性分析的免疫学法包括ELISA 法和免疫凝胶扩散法。这两种方法是根据酶与抗体之间发生反应,然后ELISA 法通过第二步反应,凝胶扩散法则通过印染过程来确定酶的活性。
这些方法非常灵敏,能够检测到极低水平的酶蛋白。但它们的缺点是对于每个产品的酶需要特殊的抗体,另外抗体能够与非酶蛋白质发生反应。由于抗体本身所用的蛋白质是特定的,因此,由不同生产者生产的同种类型的酶之间是没有交叉性的。另外,采用实验动物的敏感性也值得探讨。
2.4 凝胶扩散法
这种方法是将酶作用的底物与某种凝胶混合后倒入培养皿中,凝固之后,在凝胶上切开一条凿,倒入标准酶液和测试酶液。培养一定时间后,在切开的凝胶周围能够看到水解区域,区域的大小与酶的含量成正比。在某些情况下,还可以再加入其他试剂来显示水解的区域。如木聚糖酶活力的测定。
这种方法虽然简单,但培养时间长。因为这种方法是根据区域的大小来确定酶的活性,所以其准确性要低于其他非扩散的方法。
2.5 比浊法
以酵母或酵母细胞壁在缓冲溶液中的浊度或吸光度的降低来表示酶活力,如β-葡聚糖酶活力的测定。
2.6 体外模拟消化技术
酶活测定毕竟不能反映外源酶在机体内真实的作用效果,因此,对于体外法评定饲料营养价值的研究不断增加。体外法评定饲料营养价值是通过模拟消化道内温度、pH、消化酶分泌、胃肠运动和养分吸收等参数,在体外建立一套与畜禽消化道内环境接近的操作程序,对饲料及酶制剂进行营养价值预测和评定。常用的体外模拟消化技术包括:①胃蛋白酶—胰酶法;②胃蛋白酶—小肠液法;③胃蛋白酶—胰酶—瘤胃液法;④胃蛋白酶—胰酶—碳水化合物酶法。
由于不同的饲料用酶是不同的微生物通过发酵过程产生的,酶产品的酶学性质差别较大。并且各种微生物所分泌的酶的最佳pH 值、温度和对底物的亲和性都不相同。而目前,饲用酶除植酸酶、纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶有正式颁布的国标或行标酶活测定方法外,其他饲用酶制剂目前都还没有一个统一的定义及检测标准。因此,饲料厂家在比较不同厂家的酶制剂时,在没有统一的测定方法情况下,应首先确定自己认可的检测方法,然后在完全相同的测定条件进行检测,这样得出的结论才具有可比性。
3 酶制剂活性测定影响因素的分析
饲用酶制剂活性测定的主要影响因素有温度、pH、作用时间、底物等4大要素以及一些非定义要素,如酶液稀释度、标准曲线、显色剂、缓冲液等,下面就这几方面进行归纳分析一下:
3.1 影响饲用酶制剂活性测定的四大要素
所谓的酶活性就是指在特定的系统和条件下测到的反应速度。为了确保酶制剂测定结果的一致性,饲用酶制剂活性单位定义中对影响酶活大小的主要条件进行了规定,其中包括温度、pH 值、时间和底物,这些都是酶活力测定系统中最重要的因素,对酶促反应速度影响很大。
一方面,是当温度升高时,酶与底物的反应速率加快;
另一方面,由于随着温度的升高将使酶的稳定性下降,部分酶蛋白分子逐渐变性而失去活性,引起酶反应速率下降。
温度的这两种影响的综合作用而产生酶反应的“最适温度”。对于不同的酶制剂在不同的情况下最适温度是有一定的差别。研究木聚糖酶时发现,在30℃~40℃条件下酶活较稳定,50℃后随着温度的升高,酶活力开始下降,90℃时基本失活。研究纤维素酶最适酶解条件时发现,在36℃~58℃之间纤维素酶相对酶活随着温度升高而升高,当温度在58℃~62℃之间时,相对酶活性没有明显变化,曲线近似呈水平状态,在40℃、45℃、50℃条件下,其相对酶活分别为56%、70%、80%,而当温度大于58℃以上时相对酶活不再升高。同时,酶在不同条件下适宜温度也可能要受到酶的纯度、底物、激活剂、抑制剂以及酶促反应时间等因素的影响。
① 过酸或过碱可以使酶的空间结构破坏,引起酶构象的改变,也影响酶活性部位催化基团和结合基团的解离状态,酶活性丧失;
② 当pH 改变不是很剧烈时,酶虽未变性,但酶活受到了影响。pH 影响了底物的解离状态,或者使底物不能和酶结合,或者结合后不能生成产物。pH 影响酶分子活性部位上有关基团的解离,从而影响与底物的结合或催化,使酶活性降低可能影响到中间络合的解离状态,不利于酶解生成产物;
③ pH 影响维持酶分子空间结构的有关基团解离,从而影响了酶活性部位的构象,进而影响酶的活性;
④ pH 影响底物的带电状态。这些都直接影响酶和底物的亲和力,影响酶解反应速度。有文献报道,很多酶最适酶解pH 都在3.0~6.0。研究不同pH 值对嗜热毛壳菌木聚糖酶活性的影响发现,在pH 值3.6 以下,随着pH 值的增大,木聚糖酶的活性逐渐升高;pH 值为3.6 时,木聚糖酶的活性最高,且在3.2~4.4 范围内木聚糖酶的活性维持较高浓度,维持嗜热毛壳菌木聚糖酶活性的适宜的pH 值范围应为3.2~4.4。杨会涛等(2006)研究pH 对木聚糖酶活性影响的结果表明,该酶的最适反应pH 为6.0。洪枫等(2008)在研究木聚糖酶最适pH 值时指出,里氏木霉RutC-30 合成的木聚糖酶最适pH 值范围在4.0~5.0 之间,pH 值对木聚糖酶的酶活影响很大。
3.2 影响酶制剂活性测定的非定义要素分析
在进行酶制剂的检测过程中,除了以上分析的几点酶活定义中规定影响酶制剂测定结果的因素外,酶活测定方法中还存在许多对酶活测定结果影响很大的非定义因素,这其中包括样品酶的稀释度、标准曲线的制作、显色剂的配置、缓冲液的离子强度等。
酶活的测定在饲用酶制剂产品的质量检验、产品标签和酶活保证方面是必不可少的。酶活测定是一种非常细致的工作,以上分析了一些影响酶制剂检测的主要影响因素,但在酶制剂检测的过程中,有些细节问题对酶制剂检测也会产生一定的影响,比如:离心速度、摇匀力度和次数、搅拌时间、移液器的使用,但对一些性质不稳定的酶制剂进行检测时,这些细节问题的疏忽也会对结果产生较大的影响。所以,在饲用酶制剂酶活检测过程中,我们不但要理解影响酶制剂酶活测定的主要因素,正确把握各影响因素的关键点,对于一些其他的细小影响因素也不能掉以轻心,把酶制剂检测过程中每一个要点和步骤做好。
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