一株漆酶产生菌的筛选与发酵条件的初探
2010-10-23 09:29:57   来源：广州市博仕奥生化技术研究所   评论：0 点击：

摘  要：从老树根系旁筛选到一株产漆酶的菌株X-2，并通过对其碳源、氮源、温度、pH、装液量和接种量进行单因素试验。结果表明，其最适碳源为淀粉，氮源为氯化铵，装液量为50%，接种量为5%，pH值为5.0，温度为28℃。

关键词：漆酶  筛选  发酵条件

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，与抗坏血酸氧化酶和哺乳动物血浆铜蓝蛋白同源，都属于蓝色多铜氧化酶家族。近年来，漆酶一直是生物学、化学和环境科学等领域十分活跃的研究热点。大多数被分离鉴定的漆酶是真菌漆酶，不同来源微生物漆酶的底物特异性、分子量、最适pH以及其他的特性都不相同。漆酶广泛应用于生物、化学、物理、医学、环境等多个领域。在食品工业中，漆酶因处理食品工业废水、提高葡萄酒、啤酒的稳定性、增加焙烤制品的组织强度、改善食品感官品质等方面的应用正日益受到重视。真菌漆酶的合成水平除了决定于产酶菌株自身的产酶能力外，还受外在环境条件，如碳氮营养源、微量元素、诱导剂等多种因素的影响，通过漆酶合成影响因素的研究，寻找最适产酶条件，可以节约生产成本，最大程度提高漆酶生产效率。本文通过从土壤中筛选得到产漆酶的菌株X-2，进行了其产酶发酵条件的研究工作。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌种X-2，本研究所筛选得到的菌株。

1.1.2  土样

食堂周围老树根系旁，山坡草丛间采集新鲜土样，纸屑木渣浅埋半年后采集新鲜土样等。

1.1.3  主要试剂

鞣酸（C₇₆H₅₂O₄₆），愈创木酚。

1.1.4  培养基

初筛A：木质素20g，(NH₄)₂SO₄ 4g，琼脂为20g，微量元素，蒸馏水1000mL，自然pH。初筛B：在1000mL PDA固体培养基中加入0.4 mmol/L鞣酸(pH 5.5)。

复筛C：马铃薯去皮200g，葡萄糖20g，MgSO₄·7H₂O 2.5 g，KH₂PO₄ 3.0g，VB₁ 0.1g，蒸馏水1000mL，自然pH。

保藏培养基：PDA培养基。

微量元素混合液：MnSO₄ 29mmol/L，CaCl₂ 0.9mmol/L，NaCl 0.17mmol/L，ZnSO₄ 0.348mmol/L，FeSO₄ 0.359mmol/L，CuSO₄ 0.4mmol/L，NaMoO₄·2H₂O₂ 0.041mmol/L。

1.2  方法

1.2.1  初筛

土样采用梯度稀释涂布于A培养基，28℃恒温箱中培养6~9天，挑取单菌落接种于B培养基上，置28℃条件下恒温培养6～9d，记录菌落周围有无褐色轮环产生，记录菌落生长的直径(d₁)和变色圈直径(d₂)，并计算d₁/d₂，根据所产生褐色圈的大小，选出产漆酶能力强的菌株，并用保藏培养基留种。

1.2.2  复筛

将初筛得到产生褐色圈的菌种斜面用无菌生理盐水制备（1-2）×10⁷cfu的孢子悬液，接种3mL到25mL复筛C培养基中(250 mL锥形瓶)，28℃，150 rpm，旋转摇床振荡培养6~9d，过滤液为待测粗酶液。

1.2.3  分析方法　

漆酶活力测定：取4mL 20mmol/L乙酸钠缓冲溶液(含0.8mmol/L愈创木酚)和1mL适当稀释的发酵上清液，混合均匀后于25℃反应30min后于465nm处测定吸光度。酶活单位定义为每分钟氧化1μmol愈创木酚的酶量为1个酶活单位(U)，已知465nm处愈创木酚摩尔消光系数ξ₄₆₅=1.21×10⁴L·mol^-1·cm^-1。

2  结果与讨论

2.1  漆酶产生菌的筛选鉴定

经初筛得到4株能分解木质素的菌株，对其进行变色圈检测及酶活测定。对初筛得到的4株菌采用复筛培养基C进行摇瓶复筛，结果见表1，显示X-2菌株酶活较高，将其作为下一步研究的出发菌株。