纤维素酶活性的检测
2006-11-17 18:23:29   来源：本站原创   评论：0 点击：

目的
　　本检测方法是用来确定本公司纤维素酶类的催化活性。本方法适用于各种固体和液体纤维素酶制剂。
说明
　　本方法适合于纤维素类酶的质量分析和质量控制领域。但不是本公司产品及其它公司产品的绝对活力的预测，而各种酶制剂的最终的酶活力在良好的实验操作下仍可发挥出更好的催化活力。
原理
　　纤维素被纤维素酶水解最终降解生成β-葡萄糖。鉴于纤维素结构的复杂性，没有任何一种酶能将纤维素彻底水解。1950 年 Reese提出了 C1-Cx概念。C1是一水解因子，作用于纤维素的结晶区（如棉花纤维即为高度结晶性纤维），使氢键破裂，呈无定形可溶态，成为长链纤维素分子。再由Cx最终催化形成还原性单糖。而Cx通常包括：（1）内切葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，简称 EG)。这类酶随机水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子（羧甲基纤维素钠（CMC）即为人工合成的一种线形纤维素钠盐）截短。（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.91），又称纤维二糖水解酶（cellobiohydrolase，简称 CBH）。这类酶作用于β-1,4-糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子 。（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21，简称 BG），这类酶将纤维二糖（水杨素即为葡萄糖苷键连接的纤维二糖）水解成葡萄糖分子。
　　据上述理论，分别设计以滤纸（filter paper）、棉球、CMC、水杨素为底物，分别衡量纤维素的总体酶活性（FPA）、C1、Cx、Cb酶活性。将底物水解后释放还原性糖（以葡萄糖计）与3,5-二硝基水杨酸(DNS)反应产生颜色变化,这种颜色变化与葡萄糖的量成正比关系,即与酶样品中的酶活性成正比。通过在550nm的光吸收值查对标准曲线(以葡萄糖为标准物)可以确定还原糖产生的量,从而确定出酶的活力单位。
纤维素酶类活性的定义
　　Ⅰ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1×6cm的滤纸（FPA）产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个FPA酶活力单位。
　　Ⅱ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解50mg的脱脂棉球产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个C1酶活力单位。
　　Ⅲ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1%CMC溶液产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个Cx酶活力单位。
　　Ⅳ 1g酶粉（1ml酶液）于50℃pH4.8条件下，每分钟水解1%水杨素溶液产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的酶量定义为1个Cb酶活力单位。
程序
1. 试剂和仪器
*本标准所使用所有的试剂若无任何说明，均为分析纯
1.1 无水醋酸钠
1.2 冰醋酸
1.3 3，5-二硝基水杨酸(DNS)
1.4 无水葡萄糖
1.5 无水酒石酸钾钠
1.6 氢氧化钠
1.7 重蒸苯酚
1.8 无水亚硫酸钠
1.9 叠氮化钠
1.10 Ⅰ 定性滤纸
Ⅱ 脱脂棉球
Ⅲ 羧甲基纤维素钠
Ⅳ 水杨素
1.11 水浴锅(恒温)50±0.5℃
1.12 热干燥箱80±1℃
1.13 722型分光光度计
1.14 分析天平（感量0.1㎎）
1.15 一级玻璃制品
1.16 冰箱
2. 试剂的制备
2.1 0.1M乙酸－乙酸钠缓冲溶液（pH=4.8）
溶液A：量取冰醋酸6ml，定容至1000ml，制成0.1M醋酸溶液。
溶液B：称取8.2g醋酸钠，溶解后容至1000ml，制成0.1M醋酸钠溶液。
使用是以A：B=4：6的比例混合，低温冷藏备用。
2 .2 DNS显色剂:
溶液A:称分析纯的NaoH104g溶于1300ml水中,加入30g分析纯3,5－二硝基水杨酸。
溶液B:称分析纯酒石酸钾钠910g，溶于2500ml水中，再称取25g重蒸苯酚和25g无水亚硫酸钠加入酒石酸钾钠溶液。
将A、B溶液混合，加入1200ml水，贮存于棕色瓶中，暗处放置一星期后过滤使用。
2.3 Ⅲ CMC（1%） 准确称取1.000g羧甲基纤维素钠用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100ml。
Ⅳ 水杨素（1%） 准确称取0.25g水杨素用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至25ml。
2.4 标准葡萄糖溶液的配制
无水葡萄糖80℃烘干至恒重，准确称取100mg溶于100ml水中，加1mg叠氮化钠防腐。4℃冷藏备用。
2.5 酶样的制备
准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用pH4.8醋酸缓冲液溶解并定容至100ml，则该酶已经稀释100倍。
3. 标准曲线的绘制
3.1 取7支带有15ml刻度的试管，按下表取试剂

3.2 上述过程同时进行三个平行测试，测得OD值与葡萄糖mg数在计算机上或人工拟合曲线，求得Y=ax+b一元线性方程中间的a和b值。要求所绘曲线相关系数r≥0.999。
4. 分析程序
Ⅰ FPA活力单位的测定
4.1 取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液，再加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。
4.2 取其中3支作为测定管，各加1×6cm滤纸条，充分浸泡置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3 另一支作为空白管同时置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.4 然后分别加入DNS显色液2ml，空白管同时加1×6cm滤纸条。
4.5 放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
Ⅱ C1活力单位的测定
4.1 取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液，再加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。
4.2 取其中3支作为测定管，各加50mg的脱脂棉球，充分浸泡置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3 另一支作为空白管同时置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.4 然后分别加入DNS显色液2ml，空白管同时加50mg的脱脂棉球。
4.5 放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
Ⅲ Cx活力单位的测定
4.1 取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液。
4.2 取其中3支作为测定管，各管再加1.8ml CMC（1%），另一支作空白管，同时加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。然后置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3 然后分别加入DNS显色液2ml。
4.4 放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
Ⅳ Cb活力单位的测定
4.1 取4支15ml刻度的试管，各加0.2ml酶液。
4.2 取其中3支作为测定管，各管再加1.8ml 水杨素（1%），另一支作空白管，同时加pH4.8醋酸缓冲液1.8ml。然后置50±0.5℃恒温水浴60min。
4.3 然后分别加入DNS显色液2ml。
4.4 放沸水浴锅反应10min，冷却后加水至15ml，以空白管调零点，在550nm吸收峰下用分光光度计测OD值。
5. 活性的计算
5.1 将测得的各平行样求OD值的均值。
5.2 计算纤维素酶类的活性单位依据以下公式
　　纤维素酶活力= U/g(ml)
　　　　式中 x：为样品OD值的平均值
　　　　b和a由葡萄糖浓度和相应的OD值通过回归方程求的
　　　　n：酶粉（液）的稀释倍数
　　　　T：酶促反应的时间
　　　　0.2：所加酶液的量