毕赤酵母表达系统
2007-06-04 20:54:00   来源：转帖   评论：0 点击：

巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统［1］，它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷［2］。除此之外，由于它在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点而使得该系统成为目前研究最多、应用最广泛的真核表达系统之一：(1)它所具有的aox启动子是一种强有力的启动子，受甲醇严格诱导调控而表达，所以可严格调控外源蛋白的表达；(2)由于它可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性；(3)表达量高，迄今为止，已有300多种异源蛋白在该表达系统中获得了高效表达，如破伤风毒素片段C可达12g/L［3］，而明胶的表达量甚至达到了14.8g/L［4］，已有报道其胞内表达量惊人，甚至达到了22g/L；(4)外源基因的表达产物既可存在于胞内，又可通过其特有的信号肽α?因子或天然蛋白本身的信号肽分泌至细胞外，同时，该系统自身分泌的蛋白非常少，这大大简化了纯化过程，如表达的重组水蛭素（HIR），仅经过二步层析纯化就可达到97％以上的纯度；(5)整合入外源基因的重组子表达系统十分稳定。有文献报道通过同源重组整合入外源基因的重组子表达系统可连续培养50代却未见外源基因丢失的现象［5］；(6)糖基化程度低，毕赤酵母中加到外源蛋白每条侧链的平均长度为8~14个甘露糖残基，较之酿酒酵母每条侧链平均50~150甘露糖残基要短得多［6］，同时，由于毕赤酵母不能象酿酒酵母那样在核心多糖末端形成α?1,3?末端甘露糖，使得它的蛋白抗原性远远低于后者。因而更适合于治疗用途［7］；(7)该表达系统由于对营养要求低，培养基成份简单廉价，可进行高密度高产量的发酵培养，便于工业化生产。

1常用表达菌株及表达载体

1.1表达菌株

P.pastoris作为一种甲醇利用型酵母菌，自1969年开发以来，通过数十年的研究，至今已有多个种属被开发出来，新近发展起来的嗜甲醇酵母包括Candida和Pichia 2个种属，共有30余种［8］，其中尤以P.pastoris发展最快，研究最清楚。目前，用于外源基因表达的P.pastoris菌株为Invitrogen公司构建，主要有：Y?11430，M?G100?3，GS115，KM71和SMD1168，其中Y?11430为野生型，其余皆为组氨酸突变型，GS115有完整的aox1基因，在甲醇培养基上表型为Mut+，当用重组表达载体转化后，由于表达载体线化所用酶不同，其转化子表型可能是Mut+或Muts，可通过MD和MM培养基进行表型的鉴定；KM71的aox1基因被ARG4基因替代，虽然aox2和aox1有97％同源性，但aox2利用甲醇的能力远比aox1弱［9］，在甲醇培养基上表现为Muts，其转化子也是Muts，表型不必鉴定。SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株，特别适用于分泌表达载体，可避免表达外源蛋白被宿主菌同时表达的蛋白酶所降解，其它蛋白酶缺陷型主要还有SMD1165和SMD1163［10］。MC100?3的aox基因全部删除，不能利用甲醇，即表型为Mut－His－。

1.2表达载体

P.pastoris没有稳定的附加体质粒，所以一般用整合型载体作为外源基因的表达载体，目前常用的表达载体多是美国Invitrogen公司开发构建的。P.pastoris既有分泌表达型的，又有胞内表达型的。常用的表达载体主要有：pPIC9，pPIC9K，pHIL?S，pAO815，pHIL?D2和pPICz等，其中pPIC9，pPIC9K和pHIL?S为分泌型表达载体，而pAO815，pHIL?D2和pPICz为胞内型表达载体，不同载体除具有各自特殊的基因组件外，还具有一些共同的序列，如这些载体都包括一个