毕赤酵母表达系统
2007-06-04 20:54:00   来源：转帖   评论：0 点击：

表达盒（cassette）和一个多克隆位点。表达盒由900bp的5′aox1序列和约300bp的3′转录终止序列组成［9］，用特异的酶切割多克隆位点可以使目的基因插入到相应的酶切位点中。多数P.pastoris表达载体还含有HIS4基因，它可以作为转化体的选择标记，同时还含有在细菌中复制所必须的序列及一些选择标记，如大肠埃希氏菌的复制起始点和Amp抗性基因等；还有一些载体含有来自于aox1基因的3′端侧翼序列，它可以用来指导含外源基因的组件插入3′aox1基因位点或以基因整合的方式整合到酵母染色体的aox1位点［11］。

一般情况下，整合到酵母染色体上的基因拷贝数越多，蛋白表达量就越高。多拷贝发生在aox1或组氨酸基因位点，但同一位点同时插入多个基因的几率仅占His+转化体的1%~10％，为此，人们根据不同表达载体的组成特点，如pPIC3K，pPIC9K含有kanr抗性基因；pPICz系列含有bler基因，利用基因剂量效应，分别依靠G418R或ZeocinR的抗性水平来快速筛选除高拷贝的整合转化子。对于PAO815，一般通过多拷贝表达盒BamHI?BglII串联而先在体外用人工方法构建好多拷贝载体，然后转化到宿主菌中获得多拷贝转化子［12］。

2006, 26(1)张伍魁 等： 毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用

中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.26 No.1 2006

2基因整合及表达调控的机理

2．1基因整合

像酿酒酵母一样，表达载体通过酶切线性化之后，可与P.pastoris基因组的同源序列发生同源重组而产生稳定的重组转化子［13］。目前，把载体线性化的DNA转入到宿主菌主要有4种方法，即电穿孔法、原生质体法、PEG法和锂盐法。其中原生质体法和电穿孔法转化效率最高，且有时可得到含多拷贝外源基因的转化子，有报道称电穿孔法的转化效率可高达105/μg。同时由于电穿孔法简便、快捷、高效，故是目前最理想的转化P.pastoris的方法。P.pastoris重组可分两种情况：一种是单交换，即在HIS或5′aox的单酶切位点将质粒载体线性化，通过单交换（插入）整合入染色体，这样由于aox1基因仍然保留，所得到的转化子表型为Mut+；另一种为双交换（或替换），即外源基因通过重组替换了染色体上的aox1基因，从而造成aox1的缺失，得到的转化子为Muts。

2．2调控机制

P.pastoris的调控主要是在转录水平对醇氧化酶基因（aox）进行调控。毕赤酵母是一种甲醇利用型酵母菌，甲醇作为唯一碳源时，可在醇氧化酶的作用下，被氧化成过氧化氢和甲醛。在毕赤酵母中有2个醇氧化酶基因：aox1和aox2。aox1可受甲醇专一诱导而高水平表达；aox2虽然在序列上与aox1的同源性达97％及以上且表达的蛋白具有相似的生物学活性，但aox1的表达水平却明显高于aox2，即aox1的启动能力强于aox2［14］，故细胞中乙醇氧化酶的活力主要由aox1提供，当以甲醇为唯一碳源时，aox1基因的表达可被甲醇严格调控，使得外源基因可严格保持在“表达（有甲醇）－不表达（无甲醇）”的模式。aox1的表达可被诱导到相当高的水平，可占整个细胞可溶蛋白的30％以上。当aox1基因缺失时，aox2表达水平很低，乙醇氧化酶活力极大丧失，细胞利用甲醇能力极大降低。aox1基因主要受诱导和抑制机制调控：当以甘油或葡萄糖为碳源时，aox1的转录被抑制，而在以甲醇为唯一生长碳源时，aox1被诱导转录并表达。最近在P.pastoris中克隆到一个组成型启动子PGAP，即三磷酸甘油醛脱氢酶启动子，在它的控制下，β?Lacz基因的表达水平比甲醇诱导下的aox1的表达量更高［15］，同时，由于该组成型启动子不需要甲醇诱导，更适合于医药生产，被认为是一个很有潜力的启动子。

3外源基因自身特性对P.pastoris表达系统的影响不同的外源基因在P.pastoris的表达水平相差可达上千至几千倍，如明胶的表达量可达到14.8g/L，而鼠Scrotonin受体的