几种真菌油脂的检测与提取
2007-05-06 09:01:47   来源：郑州工程学院学报   评论：0 点击：

前言

真菌油脂在成分组成上类似于植物油,主要是中性油脂、游离脂肪酸、类脂物及不皂化物.真菌合成油脂的速度、油脂积累量和脂肪酸组成,因所用原料、培养基条件、产油菌株的不同而有显著差别[1,2].对于产油微生物,由于个体微小,菌体量少不足以检测,完全依靠传统的提取,检测动植物油的方法,将使实验建立在高成本的基础之上[3],而且事倍功半.此时观察法[4]成为首选.真菌尤其是霉菌具有坚韧的细胞壁,使我们不能直接获得油脂或者只能获得少量油脂,因此,提取前用前处理方法破坏菌体细胞[5]就显得非常必要;而真菌油脂的存在形式是游离态还是结合态也在很大程度上决定着采用的提取方法[6],这些都会导致真菌油脂的实际产量有所差别[7].

1　材料与设备

1 1　菌种

1 1 1　酵母土生假丝酵母　Ｃａｎｄｉｄａｈｕｍｉｃｏｌａ(美国典型菌种保藏中心),粘红酵母　Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａｇｌｕｔｉｎｉｓ2 0704(中国菌种保藏中心),油脂酵母　Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓｓｔａｒｋｅｙｉ2 1390(中国菌种保藏中心),啤酒酵母1　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ(郑州工程学院微生物实验室提供),啤酒酵母2　Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ(郑州工程学院微生物实验室提供).1 1 2　毛霉卷枝毛霉Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ3 2208(ＣＧＭ ＣＣ),卷枝毛霉Ｍｕｃｏｒｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ3 3680(ＣＧＭ ＣＣ).1 2　培养基1 2 1　斜面培养基大麦芽汁培养基,马铃薯葡萄糖培养基.1 2 2　液体发酵培养基麦芽汁或马铃薯培养基,合成培养基(不同菌种所用的合成培养基参见文献[8～11]),半合成培养基(50%麦芽汁或马铃薯培养基,50%合成培养基).

2　实验方法

2 1　菌种培养[12]

2 1 1　菌种活化将菌种接到ＭＤＡ、ＰＤＡ斜面培养基上,酵母28℃培养3ｄ;毛霉30℃培养5ｄ.

2 1 2　种子液的制备活化菌种以少量无菌水洗入装有80ｍＬ种子液培养基的250ｍＬ三角瓶中,转速150～300ｒ/ｍｉｎ,24～30℃,培养2～3ｄ,培养温度、时间、摇瓶速度依菌种的类型和菌体的生长速度而定.

2 1 3　摇瓶培养500ｍＬ的三角瓶内装110ｍＬ的液体发酵培养基,接入种子液2～3ｍＬ,温度、转速同上,培养时间比种子液培养延长1～2ｄ.

2 2　菌体收集酵母、毛霉均采用4000ｒ/ｍｉｎ,15ｍｉｎ离心收集.

2 3　菌体油脂的检测2 3 1　苏丹黑染色法定性分析菌体油脂方法1:培养好的菌体按常规方法涂片、热固定,用苏丹黑Ｂ染色15ｍｉｎ,倾去染料,二甲苯冲洗至洗脱液无色,再用沙黄复染2ｍｉｎ,水洗、吸干后镜检.细胞和菌丝呈红色,菌体内的脂肪颗粒呈蓝黑色[4].方法2:将滤纸覆盖在菌体上,用手轻压,把沾有菌体的滤纸置于50℃下干燥20ｍｉｎ后,将其浸入苏丹染色液中染色20ｍｉｎ,再将滤纸浸入95%乙醇中脱色3～5ｍｉｎ,脱色重复两次,观察滤纸上菌体颜色[13].

2 3 2　苏丹黑染色法定量分析菌体油脂[14]培养好的菌体经离心,蒸馏水洗去所含营养物,制成与培养液等体积的悬液,取2支试管,各加入5ｍＬ该悬液,一管用苏丹黑染色,以另一管未染色细胞作对照,在580ｎｍ测定吸光度,由此来确定油脂浓度.

2 4　前处理方法2 4 1　酸处理取一定量的菌体,用40倍体积的1ｍｏｌ/Ｌ盐酸配制成菌悬液,121℃下维持10ｍｉｎ,使细胞壁水解,达到破壁的目的[15,16].2 4 2　反复冻融将菌体置于冰箱-20℃[8]冷冻过夜后取出融化,反复冻融3次,通过慢速冷冻过程中细胞体内生成的大冰晶及反复冻融的过程来破坏细胞壁.

2 4 3　超声波破壁在超声波清洗器中加入水,将菌体悬液置于玻璃烧杯内,以水为介质,处理15ｍｉｎ,通过超声波高频振动产生的空穴效应达到破壁的目的.

2 5　油脂提取

2 5 1　氯仿 甲醇法[17]

2 5 2　索氏抽提法

3　结果与讨论

3 1　菌体油脂的观察结果

使用方法1,分析酵母菌体油脂,结果见图1至图5的酵母菌体油脂照片.

　　从图1～5可以看出,土生假丝酵母、粘红酵母、斯达克油脂酵母均有明显的脂肪粒或油滴,且粘红酵母的脂肪粒位于胞外的一圈,土生假丝酵母的脂肪粒分布于假菌丝内;斯达克油脂酵母菌体内油脂呈油滴状,因而胞内油脂是片状,而不是粒状,观察起来也不如脂肪粒清晰.显然啤酒酵母、金啤酵母菌体为红色,很少有脂肪粒或油滴.对于毛霉,由于菌丝缠结成团,且其细胞壁常常难以脱色而被苏丹黑染为浓重的蓝黑色,再加上生长状况不同,染色状态也不稳定,因此无论方法1还是方法2对毛霉苏丹黑染色都不成功.

3 2　苏丹黑染色法定量测定菌体内脂的分析苏丹黑染色法测吸光度确定菌体油脂浓度的结果见图6.油脂浓度的值来源于粗脂肪的重量与培养液体积的比.

　　根据图6,只要得到少量培养好的菌体,即可用苏丹黑染色法确定吸光度,再从标准曲线估算油脂浓度.这种方法方便快捷,前后只需30～40ｍｉｎ;不需要通过物理或化学方法破碎细胞壁和进行常规的溶剂抽提.只要确定了吸光度和油脂浓度的标准曲线,就能很快地得出结果.用该方法预测菌体的含油量,能够及时决定取舍,避免了后序工作中许多不必要的劳动,也节省了时间.该方法的缺点是发酵液中生物量浓度高于25～30ｇ/Ｌ时(本实验中最大浓度达60ｇ/Ｌ),直接测量吸光度就有较大的误差,这是因为细胞核中的染色质会对测量产生影响,因此必须把样品液稀释到一定程度,或加入盐酸处理后再进行染色.此外,该方法还要求样品液均匀稳定,实验中卷枝毛霉经发酵培养,菌丝缠结成团,不能很好地分散于水中形成均匀的悬液,所以该方法只适于测定酵母这类菌体的油脂浓度.3 3　前处理方法对油脂得率的影响

3 3 1　土生假丝酵母土生假丝酵母经摇瓶培养5ｄ,离心收集,混匀,用吸水纸吸去一定的水分,分别称取约5ｇ的湿菌体5份,用以下几种不同的前处理方法处理,在60℃下真空干燥,称干重,采用氯仿 甲酵法(添加一定量的水)提取油脂,计算油脂得率,结果见图7.

3 3 2　卷枝毛霉卷枝毛霉3 2208经摇瓶培养6ｄ,离心收集,用吸水纸吸去一定的水分,称取约10ｇ的湿菌体5份,采用不同的前处理方法处理,在60℃下真空干燥,称干重,用索氏抽提法提取油脂,计算油脂得率,结果见图8.

　　从实验结果来看,用超声波和盐酸破壁效果都不错,但用盐酸破壁操作复杂,所需时间较长,大规模生产时会对环境造成污染;冷冻处理比反复冻融破壁效果略差一些;而以真空干燥处理效果最差.考虑到菌体结构上的差异,可采用不同的方法处理.比如毛霉的细胞壁比较坚韧,不易破坏,可以同时采用几种方法,如同时采用超声波和冷冻的破壁手段,先进行超声波处理,再反复冻融3～5次;而对于土生假丝酵母,直接用超声波破壁15ｍｉｎ就可达到要求.

3 4　提取方法对油脂得率的影响提取方法主要有干法(乙醚索氏抽提)和湿法(氯仿 甲醇抽提)两种.由于含油率及油脂得率的计算以干菌体为基础,干燥是必须的步骤,这就使得干法操作更加方便.然而,对于含水率高达75%～90%的湿菌体,用湿法提取更加适合,抽提更加彻底,也节约能源,但实验步骤多,操作复杂.

　　在抽提油脂的过程中,对于土生假丝酵母,用乙醚作浸取溶剂时出油率只有3 82%.把经过乙醚抽提后的酵母干菌体润湿,再用氯仿和甲醇的混合液(2∶1配成)抽提,还能抽提出10%以上(见表1),所以最终选用氯仿、甲醇的混合液作为土生假丝酵母的浸取溶剂.氯仿、甲醇和试样中的水分形成3种成分的溶剂,可把包括结合态脂类在内的全部脂类提取出来[17].由此也可以推测土生假丝酵母的菌体内脂多以结合态的形式存在.对于卷枝毛霉3 2208用乙醚进行抽提,其出油率略低于氯仿 甲醇混合溶剂,但索氏抽提法操作方便,因此仍用乙醚做浸取溶剂.但在选定了菌株,确定了优化的产脂条件后,则用氯仿 甲醇抽提,以得到大量油脂用于测定物性指标.

4　小结用苏丹黑染色对酵母菌油脂进行定性观察、定量分析是一种行之有效的方法,能在短时间内不经菌体油脂抽提等繁琐步骤,反映菌体的产脂情况.不同前处理方法对菌体细胞壁的破坏程度不同,酸处理和超声波处理效果较好,真空处理效果最差.氯仿 甲醇法适于从水分含量较高的材料中进行油脂的抽提,尤其是结合态油脂,因此对于酵母菌,该方法尤为必要.