毕赤酵母表达系统
2007-06-04 20:54:00   来源：转帖   评论：0 点击：

表达量仅为0.001g/L，HIV表面糖蛋白甚至不能表达［16］。这主要是由外源基因自身的特性所决定的。外源基因主要在以下几个方面影响P.pastoris对其自身的高效表达：(1)有些A+T含量高的基因在P.pastoris表达时会造成转录的提前终止,其共有序列ATTATTTATAAA就是一个典型的转录终止信号同时A+T含量高的序列中还可能存在一些不太确定的转录终止信号,故对A+T含量丰富的基因最好是重新设计序列，使A+T含量控制在一个理想的理论范围之内。 (2)外源基因序列中的mRNA 5′端非编码区(5′?UTR)的核苷酸序列和长度是影响外源基因能否高效表达的又一重要因素,适当长度的5′?UTR可极大地促进mRNA的有效翻译。5′?UTR太长或太短都会造成核糖体40S亚单位识别的障碍。aox1基因的5′?UTR长为114bp并富含A+U时,其编码的乙醇氧化酶表达量极高,这提示我们使外源mRNA的5′?UTR尽可能和aox1 mRNA的5′?UTR相似是必需的，有报道这种方法可使人的血清白蛋白(HSA)的表达量提高50倍之多［17］。(3)酵母菌对外源基因的表达还和外源基因的密码子的选用有关,有些表达系统的宿主在密码子的使用上具有明显的偏爱性，在酵母中表达量较高的基因往往采用的都是酵母所偏爱的密码子，在所有的61个密码子中,有19~25个是酵母所偏爱的密码子，高表达的基因几乎毫无例外地使用这25个偏爱的密码子［18,19］。目前，一般通过截取基因中影响其生物活性的部分或进行同义点突变以高利用率的密码子替代同义的低利用率密码子的方法来提高外源基因的表达水平，如P.pastoris表达植酸酶时,把酵母使用频率低的精氨酸密码子突变为使用频率较高的密码子，可使表达量提高37倍［20］。(4)外源基因的拷贝数也是影响其能否在P.pastoris高效表达的一个重要因素。虽然许多实例表明含单拷贝外源基因表达框的宿主菌有时足以获得最佳产量,但在大多数情况下,随着拷贝数的增加外源蛋白的表达量也会相应增加，如重组鼠表皮生长因子(mEGF)在P.pastoris中的表达量与其含外源基因拷贝数成正相关。但也有研究发现，有些基因的高拷贝反而会降低其表达水平，推测可能是分泌效率低的蛋白在过高表达的情况下会对分泌途径形成负反馈抑制所引起的。因此，基因拷贝数对表达量的影响是无法预测的，高表达菌株的筛选只应以表达蛋白量的高低为唯一标准。

另外，表达条件(如培养基、通气量、菌株及载体的选择等)及所表达外源蛋白的特性也都会影响外源基因在P.pastoris中的高效表达。

4P.pastoris表达产物的糖基化4．1N?和O?糖基化

P.pastoris能对表达的蛋白进行N?和O?糖基化，其中由于N?糖基化发生较多且其对许多蛋白质的折叠、药物动力学的稳定性及功能是必需的，故对其研究也相对较为深入。当蛋白质含有一致性序列Asn?Xaa?Thr/Ser（Xaa代表任何氨基酸）时，P.pastoris能对其中天冬氨酸残基上的酰胺氮进行糖基化，即产生N?糖基化。若对蛋白质中的苏氨酸/丝氨酸上的羟基进行糖基化即产生O?糖基化。P.pastoris的糖基化程度比酿酒酵母小但比哺乳动物大［21］。P.pastoris的N?、O?糖基化作用从内质网开始，在高尔基复合体中进一步加工修饰。研究表明O?糖基化对蛋白质形成正确的空间结构至关重要［22］，可能由于到目前为止检测到的大多数糖蛋白中O?多糖比例极少，故与N?糖基化相比其研究也较少。虽然P.pastoris表达蛋白的糖基化过程与酿酒酵母十分相似，但二者也存在着差异：首先，前者表达蛋白每个侧链的平均长度（8~14个甘露糖残基）比后者（50~150个甘露糖残基）要短得多，这可能使得前者对表达蛋白质性质的影响较后者要小得多。此外，P.pastoris不能在寡聚糖链添加α?1,3?末端甘露糖,而酿酒酵母则很容易形成α?1,3?末端甘露糖,该形式连接的多糖被认为是酿酒酵母表达的蛋白质具有抗原性的原因之一。到目前为止,对