乳酸菌富集钙的研制
2007-12-16 22:25:33   来源：本站原创   评论：0 点击：

钙是人体中含量最丰富的矿质元素,约占人体重的2%,即1.3kg[1]。其对血液凝固、神经肌肉的兴奋性细胞的黏着、神经冲动的传递、细胞膜功能的维持、酶反应的激活以及激素的分泌等,都有决定性的影响。贻贝(mussel)又名壳菜,是一种普遍养殖的海洋贝类,产量大。仅舟山每年就有数十万t贻贝需要加工,产生大量贻贝壳,没有被充分利用,造成资源浪费。贻贝壳中含有大量的钙质,主要成分为碳酸钙,占95%以上,此外还含有少量有机物及微量元素Zn、Mg、P、Si、Fe、K等[2]。结合态的钙制品要消耗胃中一定量的胃酸,从而引起胃部不适。医学界认为好的钙吸收和利用与摄入钙形态,以及适宜的钙磷比和氨基酸的存在有密切的关系[3]。利用肠道有益菌-乳酸菌发酵天然富含钙质元素的超微粉碎贻贝壳粉,不仅由于乳酸菌代谢产生的酸使结合态的钙转变成了游离的钙离子,使无机钙转变成为有机钙,而且还提高了钙的转化率。同时乳酸菌是肠道有益菌,若将贻贝壳粉经发酵加工成含有菌体的补钙制品,可大大地改善肠道的消化吸收功能。
1材料和方法
1.1实验材料
1.1.1原料保加利亚乳杆菌(Lactobacillus Bulgaria)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus):浙江海洋学院食品科学与工程实验室提供;贻贝壳:浙江省嵊泗贻贝无公害养殖基地提供,品系由本校生物系赵盛龙教授鉴定Mytilus corusus Gould;培养基:MRS培养基、脱脂乳培养基,均按参考文献[4]制备。
1.1.2仪器与设备AO型台式微型气流粉碎机,SpectraAA220系列原子吸收分光光度计,SB-JC-1A
洁净工作台,SPX智能生化培养箱,DL-5低速大容
量离心机,LDZX-40B1压力蒸气灭菌锅,DGG-9140
恒温干燥箱。
1.2实验方法
1.2.1超微贻贝壳粉的制备贻贝壳→清洗→蒸煮→去杂→清洗→风干(70℃、10h)至含水率为3%→捣碎→粗磨→细粉碎→超微粉碎,获得3种直径的贻贝壳粉颗粒(1#、2#、3#),常温下保存备用。
1.2.2贻贝壳粉矿质元素分析参照GB7887-1987,
用原子吸收分光光度仪测定[5]。
1.2.3纯菌种的活化纯化后的保加利亚乳杆菌、
嗜热链球菌分别接种于脱脂乳培养基中,40℃培养6h,连续扩培3次。
1.2.4种子液及发酵液的制备种子发酵液:按添
加量超微贻贝壳粉15%、蔗糖5%、脱脂乳10%、蒸馏水70%的比例将各成分装入瓶内,121℃灭菌15min。
发酵液:将超微贻贝壳粉、蔗糖、蒸馏水以2.2正交实验设计方案制备发酵液。
1.2.5乳酸菌发酵超微贻贝壳粉菌种选择把活化好
的两种第三代乳酸菌按保加利亚乳杆菌(Ⅰ)、保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1∶1(Ⅱ)、嗜热链球菌(Ⅲ)以3%
的接种量在无菌条件下接种于种子液中,在38~39℃恒温箱内培养24h,然后把培养好的种子液以无菌条件下接种于发酵液(500目的超微贻贝壳粉10%、蔗糖5%、蒸馏水85%)中,于44℃间歇振荡培养发酵24h,进行单因素实验,依次进行活菌数、离子钙含量测定。
1.2.6乳酸菌发酵超微贻贝壳粉最佳发酵时间的确定
把活化好的两种第三代乳酸菌按保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1∶1的比例按1.2.5中操作进行发酵,
依次进行发酵时间为24、30、36h的单因素实验,测定活菌数、离子钙含量。
1.2.7乳酸菌发酵超微贻贝壳粉生产条件优化把活
化好的两种第三代乳酸菌按保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1∶1的比例混合后,再以3%的比例在无菌条件下接种于种子液内,在38~39℃恒温箱内培养24h,然后把培养好的种子液以无菌条件下按正交实验方案接种于发酵液中,于44℃间歇振荡培养发酵30h,依次进行活菌数、离子钙含量测定。
1.2.8离子钙含量的测定移取2mL发酵物离心
(3000r/min,5min)除去大颗粒沉淀,取上清液离心(5000r/min,15min)除去大量菌体[6],再经细菌滤器过滤上清液,然后吸取上清液50!L硝化,钙原子吸收测定[5]。
钙转化率(%)=离心上清液钙量/原样总钙量×100

2结果及分析
2.1贻贝壳粉的金属元素组成

从表1可看出,超微粉碎的贻贝壳粉体中,钙含量占35%,还含有丰富的铁。粉体中还含有多种矿质元素,多数为生物体生长发育所必需的;Hg、Cd等有害元素含量远低于国家标准,其食用性较安全。
2.2乳酸菌发酵贻贝壳粉单因素实验结果
2.2.1乳酸菌发酵贻贝壳粉菌种选择结果

通过表2发现,保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌=1:1的作用效果最好,保加利亚乳杆菌单独作用效果次之,而嗜热链球菌单独作用的效果最差。故实验后续阶段都采用将保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌以1:1的比例混合发酵超微贻贝壳粉,从而获得更高钙离子转化率的生物态补钙剂。
2.2.2乳酸菌发酵贻贝壳粉最佳发酵时间的确定

由表3可知,乳酸菌作用的最佳发酵时间为30h,时间过高或过低都会对发酵结果有影响。发酵时间过短,乳酸菌作用不彻底,钙离子转化率偏低;发酵时间过长,则会造成一部分菌株死亡,从而降低钙离子转化率。故在以下实验中,均选择30h作为乳酸菌的发酵时间,以得到最佳生产工艺,从而得到高钙离子转化率的微生态补钙制品。
2.3乳酸菌发酵贻贝壳粉生产条件优化正交实验
本设计在前人研究基础上,根据相关资料选择贻贝壳粉粒度(A)、乳酸菌接种量(B)、蔗糖浓度(C)、贻贝壳粉发酵液浓度(D)为4个因素,各取3个水平,采用正交表L9(34)的设计方案,正交实验因素水平表和正交实验结果及极差分析表分别见表4、表5、表6。

从正交实验数据和处理结果表中的极差(R)表明,对钙离子转化率影响最大的是贻贝壳粉粒度(A),然后依次是贻贝壳粉发酵液浓度(D)、乳酸菌接种量(B)、蔗糖浓度(C),最佳提取组合为A3D2B1C1,即贻贝壳粉粒度为1000目、贻贝壳粉发酵液浓度为20%、乳酸菌接种量为3%、蔗糖浓度为5%。为进一步判断实验误差与实验条件是否影响实验效果,将正交实验数据进行方差分析,找出这些因素中起主导作用的变异来源。结果见表6,可以看出贻贝壳粉粒度、贻贝壳粉发酵液浓度对提取率起主导作用,而乳酸菌接种量、蔗糖浓度影响较小。
3结论
本实验通过对超微贻贝壳粉接种乳酸菌发酵的研究,初步探索了发酵后菌体存活数量及发酵产生游离钙含量变化。实验表明,贻贝壳粉颗粒越小,贻贝壳粉中结合的物质转化溶解越充分,发酵产生的游离钙越多,且最高钙离子转化率为29.6%,此时活菌数也相应达到最高值,即3.7×1010cfu/mL。在人体的体液中发挥生理作用的主要是游离钙,而经乳酸发酵后恰好把贻贝壳粉中的化合钙转变为游离钙,促进人体吸收。而且乳酸菌利用发酵液中的糖及其他成分进行生长代谢不断产生乳酸,在酸性环境中钙离子溶解度会增大,更有利于吸收。本实验的研究为贻贝壳的综合利用与开发生物态补钙制品的研制提供了理论依据,并开发出一种新型的生物态补钙制剂。