Nisin的发酵生产条件和纯化研究
2007-12-03 21:37:27   来源：China Food Additiv   评论：0 点击：

　　Nisin,又称为乳酸链球菌素,乳酸链球菌肽或尼可素,是由某些乳酸菌(Lacrococcus lactis)在代谢过程中合成的小分子肽,其成熟分子仅含有34个氨基酸残基;在天然状态下,Nisin主要有两种形式,分别为NisinA和NisinZ,它们之间的差别仅在于氨基酸序列中第27位的氨基酸不同,在NisinA中是组氨酸,在NisinZ中是天冬氨酸。NisinA的结构如图1所示:
　　Nisin可以抑制食品中革兰氏阳性菌的生长,如微球菌、分枝杆菌、棒杆菌、葡萄球菌和乳酸菌等,对于梭状芽孢杆菌也有很好的抑制作用,能有效阻止孢子的萌发和毒素的生成。Nisin对革兰氏阴性菌基本无影响,但通过和某些络合剂(如ED-TA或柠檬酸)等协同作用抑制之。因此,Nisin可显著的延长食品的保存时间或缩短杀菌所需的时间,在乳制品、肉制品、罐装食品及植物蛋白食品等的保藏与防腐方面都有很好的作用。对Nisin毒理和生物学的研究表明,使用Nisin的安全性较高。它的半致死剂量(LD50)约为7g/kg,与普通食盐相近。1969年FAO/WHO批准Nisin为食品添加剂,到目前为止,已有50多个国家和地区批准使用,这也是现阶段唯一被许可用于防腐剂的细菌素(bacteriocin)。
1953年,Nisin开始工业化生产,当时最大的生产者是英国的Aplin&Barrett公司,其产品Nisaplin的效价为1×106IU/g(1IU相当于0. 025μg纯Nisin)。丹麦Chr Hansen公司生产的Nisin制品-Chrisin,效价为0.9×106IU/g。
一、Nisin的发酵生产
Nisin的生产是和生长密切相关,它通常发生在整个生长阶段。从新陈代谢的角度来看,Nisin通常被认为是基础代谢物,也就是说,产率仅依赖生长率。但即使Nisin的生产和生长相联系,由于许多影响其生产和吸附的因子之间的相互作用,细胞达到最大生物量时并不一定会使Nisin有最大产量。这可通过细菌素积累模型(方程式1)进行说明:
rp=αrx+βX　　　　　　　　　　(1)
式中:γp和γx:分别指细菌素的产率和菌体的生长率;α和β是需要在实验中确定的参数。
将(1)式变形,即得:
rp
X=αrXX+β;即rpX=αμ+β　　　　(2)
这样,生物代谢可以分为3类:
①基础代谢:当β=0时,细菌素产率仅由菌体生长率所决定;
②二级代谢:当α=0时,细菌素产率仅由菌体数量所决定;
③综合代谢:当β≠0,α≠0时,细菌素产率由菌体生长率和数量共同决定。对于某些细菌素而言,产率和细胞的生长率确实是呈近似的线性关系的,也就是说,它们是近似符合基础代谢的;但是,人们观察到:不论是连续生产还是分批间歇发酵,Nisin的产率和细胞的生长的非线性关系非常明显。分批发酵中,菌体指数生长阶段后期,Nisin的合成增加,显然和细胞生长不一致。Barcena等人认为,由于nis基金在指数生长初期就有表达,因此Nisin产量在生长后期的增长,是基于碳源对Nisin前体修饰基因的表达与活性调节。
1　培养基
Nisin的发酵生产主要是在乳酸链球菌菌株培养基加碳源(通常是蔗糖)、氮源(如蛋白胨、酵母粉)、无机盐类,吐温等得到。发酵的效果主要受到碳源和氮源的影响,磷酸盐、阳离子、表面活性剂和抑制剂的种类和含量对生产也有很大影响。
1.1　碳源
Nisin生产常用的碳源有蔗糖,葡萄糖等。实际生产中,蔗糖被证明是最好的碳源;果糖和乳糖可以产生相当大的生物量,但是Nisin的产量却很低。在控制pH的分批发酵中,单位生物量的Nisin产量和终了时的Nisin浓度都受到初始糖浓度的影响。Devuyst等人曾以蔗糖为碳源,培养乳酸链球菌亚种NIZO22186(Lc.lactissubsp.lactisNIZO22186),在蔗糖浓度为30g/L时,Nisin的单位产量最大。但是,当随着蔗糖浓度从30 g/L增加到40g/L时,即使有更多的生物量产生,单位生物量生产的Nisin还是从19.1mg/L减少到10.9mg/L,这可通过碳源对Nisin前体(prenisin)修饰基因的表达和活性的调节来解释。M.L.Cabo等注意到,当为Nisin的生产在遵循某个pH变化达到最大的生产效率的时候,仅有20%的蛋白质被消耗,而葡萄糖则被完全消耗。因此他们认为,定期的加入葡萄糖将对生产有利。这个结论在随后的试验得到了证明。对于其它的碳源也有相似的结果。由此我们可以确定,间歇补充碳源有利于提高Nisin产量。
1.2　氮源
乳酸菌是对营养非常挑剔的微生物,菌体生长及其细菌素的生产,在更多的时候是受到有机氮的限制而不是碳源。Nisin产量随着氮源量的增加而增加。氮源的种类对Nisin的生产也有很大的影响。研究显示,以棉籽粉(10g/L)为氮源,Nisin的效价最高,达2500IU/ml,以酵母提取物和鱼粉作氮源,也可获得较高的Nisin产量(>2000IU/ml)。Van’t Hul和Gibbons曾用乳酸链球菌亚种ATCC11454(Lc.lactissubsp.lactisATCC11454)分别在LTB肉汤和一种未加工的氮源中培养,发现后者的Nisin产量比前者多1.5倍。但是在常见的氮源中,如鱼蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母膏和牛肉膏等有机氮源之间,差异体现的并不是很明显。此外,在基本的培养基(以蔗糖为碳源,添加8种必须氨基酸和5种维生素)中添加Nisin前体氨基酸,如半胱氨酸、苏氨酸和丝氨酸等,有助于发酵液中Nisin效价的提高。
1.3　其它因素
阴离子(磷酸根)能促进细菌素生产。以2%的蔗糖为碳源,比较不同无机磷源对乳酸菌菌株SM526的生长和Nisin合成的影响,如表1所示。6种磷酸盐都能较好的促进菌的生长和Nisin的合成。这可能是由于磷酸盐有较强的缓冲能力,能够缓冲由于乳酸的产生而造成的培养基pH下降,从而提供适于该菌生长的pH条件。在所用的磷源
中,以KH2PO4的效果最好,但(NH4)2HPO4和(NH4)H2PO4效果较差,这可能是由于NH4+的拮抗作用,不利于菌体的代谢。
　　但这种促进作用并不是在所有的试验中都得到了证实,比如无机硫酸盐可以改善用菌种Lc.Lactissubsp. LactisNIZO22186进行的Nisin生产(DeVuyst和Vandamme 1993),当添加50g/l的K2HPO4的磷酸盐时,在pH6.8处的分批发酵中可获得最好的结果(3500 IUml-1)。然而,对菌种IO-1而言,磷酸盐的刺激性影响却没有得到证实(Matsusaki等1996)。这说明磷酸盐影响的是具体菌株。Ca2+,Mg2+等阳离子也能影响细菌素生产,但这种影响同样不具有普遍性。已有报道,Mg2+在用菌株Lc.lactis subsp. LactisATCC11454的试验中改善了Nisin的生产,并显著减少了细胞对Nisin的吸附;但在用菌株IO-1进行的Nisin生产中却没有发现类似的促进作用。这可能是由于Mg2+可通过保护细胞质膜的完整性来增强Nisin对主要肽酶NisP的免疫力,或是降低了NisinZ在细胞表面的吸附。还有研究发现,添加少量的CaCl2(如0.1mol/l)能增加NisinZ的最大浓度以及比产率。吐温—80会促进一些包括Nisin在内的细菌素的生产。吐温的影响主要是阻止细菌素在聚丙烯玻璃状膜上的吸附,这样可以增加表面细菌素的效价。加入酒精(1% v/v),可改善类似的细菌素S和amylnovorin L471生产。这可能是由于这些物质影响了Nisin基因的表达,或抑制了细菌素的聚合。但这种作用在Nisin生产上尚未得到确认。
2　发酵条件
2.1　pH值
乳酸菌的生长会伴随有乳酸的生成,造成pH的下降。但低的pH对菌株生长不利,因此需要控制pH来改善乳酸菌的生长。这种方法可以改善与菌株生长紧密相关的细菌素的生产。一般认为,保持pH恒定,将形成的酸中和对Nisin的生产有利。生产中常用两种办法:开始的时候缓冲培养介质;或连续的加入碱。这个结论似乎更大程度上是来自于经验。因为人们加入缓冲培养介质虽然是为保持恒定的pH值,但由于一些缓冲物等提供的营养如磷酸盐和柠檬酸盐等对生产也有促进作用,因此不能把所有观察到的促进效果都归因于保持了恒定的pH值。Geis等人在没有缓冲的培养基中也得到了高含量得Nisin和其前体(pediocin);De Vuyst和Vandamme分别在缓冲和没有缓冲的介质里面生产Nisin,得到的产量也没有很显著的区别。因此,对于缓冲液的作用还有待于进一步研究。M.L.Cabo等人提出了一个假设,即真正决定Nisin产量的是pH值的下降梯度(VpH),这个梯度越陡,对生产越有利。生产可以通过将最后稳定的酸性pH反复碱化至初始pH(中间的间隔时间大概是6小时)而使Nisin产量翻倍。这个假设在其用菌株ⅡMLb 1.13进行的相关的对比试验中得到了比较吻合的结果。但这个结论是否对其它菌株也有效,还需要进一步的研究。在决定最优的pH问题上,大多数认为pH应在5.8~6.0之间对于恒定pH值生产Nisin是合适的,这通常低于最佳生长pH。但是这个pH值范围不能推广到所有其他细菌素的生产,比如有几种细菌素的生产只有在低pH(5.0)处才最佳,这也是随菌株或菌种而定的。而在M.L.Cabo的反复碱化的生产方法中,起始的pH为6.5-7.5时,Nisin的生物合成达为最大。
2.2　通气和搅拌
De Vuyst和Vandamme曾经提出,一般Nisin生产需要隔绝氧气,并适度的搅拌。Lc.lactisIO-1在pH5.5的葡萄糖培养基中发酵,搅拌速度为3200r/min时,Nisin浓度达到最高,为3940IU/ml,单位生物量的Nisin产量为68.5mg/g,1000r/min时,Nisin浓度和单位生物量的Nisin产量略有降低,分别为3410IU/ml和68.5mg/g。而在木糖培养基中,拌速度大于540r/min则会抑制菌体生长和Nisin生产,这似乎是一个特例。有研究显示,10~40ml /min的通气明显减少了Nisin的产量,这或许是因为发生了化学降解或影响了基因的表达。但M.L.Cabo等最近提出,Nisin的产量会随着氧气饱和百分比(pO2)而逐步提高,在一定的范围内甚至能成倍增长。这个结论比较接近于早期Amiali等的研究果,pO2值为60%时对Nisin生产是最有利的。尽管这些差异也可能是因为菌株的不同引起的,但最近的研究表明,在单位体积的生物量不相应增长的情况下,溶解氧对Nisin的生产有直接的影响。这也说明
Nisin生产是一个有氧代谢的过程。
2.3　连续发酵和分批培养
连续发酵可以维持菌体的高生长率,因此细菌素产率在连续发酵中应该有改善。对选定细菌素而言,表对分批培养和连续发酵中的生产情况作了比较。在用Lc.lactis subsp. LactisATCC 1154进行的连续发酵过程中,稀释度D=0.25h-1时,nisin的浓度、产量和单位产率最大,在更高和更低的D处则迅速下降。此外,黏附于细胞上的Nisin水平和单位乳酸增长率,都会影响Nisin常量。D值增加使得生物量和细菌素浓度下降,培养基及培养基洗脱液中底物浓度高。因此,可以将生产细胞回收再次发酵,或是用固定细胞进行底连续发酵(如表2所示)。用菌种Lc.lactis subsp. LactisIFO12007并配以回收细胞进行的连续发酵,和分批发酵比较起来,Nisin效价增加,Nisin生产能力增强(体积测定)。流加高底物浓度培养基时,Nisin生产能力却下降,这可能是由于高的乳酸浓度抑制了菌
株生长和Nisin生产。,Chinachoti等发现用回收细胞进行的连续发酵(用陶瓷膜保留细菌素)可在高稀释度下生产NisinZ,和没有用回收细胞的分批发酵或是连续发酵比较起来,在生产能力上有一定改善。
　　
2.4　自由细胞和固定化细胞生产
与游离细胞相比,海藻酸钙作为包埋固定细胞生产Nisin的生长期延迟了约4h,产Nisin的时间也相应推迟,生产能力也有所下降。这可能是由于海藻酸多聚物包围在细胞外,阻碍了物质的传质扩散作用;同时Ca2+和细胞膜成的络合,改变了细胞的微环境和生理状态,从而影响了生产性能,但这种情况可以通过连续化发酵改善。有研究发现,固定化细胞连续发酵的Nisin产量,要高于分批和半连续化发酵的产量,接近于游离细胞的水平。这可能是由于连续化生产所用的固定化细胞始终保持在指数生长期,生理活性比较高;其次,随着新鲜培养基的流加,一部分代谢产物如乳酸和Nisin被移开,降低了产物的反馈抑制作用。在反复的分批发酵和连续发酵中,必须及时除去磷酸盐和添加CaCl2,以维持海藻酸钙的稳定性。在连续发酵方式中,固定化细胞允许比游离细胞生产系统的稀释度D更高,并且,尽管固定细胞生产Nisin的效价比游离细胞的低,但是在D增加到0.3h-1时,Nisin生产能力增加到3.89×105IU /L/h。以可再生的光交联凝胶体ENTG-3800固定细胞,合成Nisin效价最大可达3000IU/ml,产量达
到2.5×106IU/g干重。现阶段,固定细胞颗粒的稳定性和连续培养时间,仍然是首先需要解决的问题。
二、Nisin的纯化与精制
在实验室条件下,从含有大量肽(10-30 g/L,其中含Nisin10-100 mg/L)的发酵肉汤中提取纯化isin,主要是利用其阳离子表面活性和不易溶于水的特性。主要步骤包括,硫酸铵沉淀、阳离子交换色谱、RP-HPLC纯化等。其中,色谱可以用等电点凝聚代替,免疫亲和色谱还可一步纯化NisinA。尽管从产量和纯化上来看,这样得到的Nisin具有
很高的纯度,但对于大规模的回收和纯化却是不实用的。1953年刚开始工业化生产Nisin时,由于纯化成本太高,仅进行了喷雾干燥,得到的粉末再用NaCl标准化至1×106IU/g。现阶段,大规模的回收与纯化Nisin大都以吸附/解吸或相分离为基础。Nisin在pH6.0-6.5可被Nisin的生产细胞吸附,然后在pH2.0、0.1mol/LNaCl条件下从细胞分离或解吸。这个方法被证明非常有效。然而,当Nisin的浓度非常高的时候,就会超过细胞吸附Nisin的能力,只能部分回收Nisin。
细菌素可以在HIC和阳离子交换树脂上吸附。Stoffels等人以HIC和阳离子交换树脂吸附Nisin,仅用两步就将细菌素Nisin纯化到几乎100%,纯化倍数达到60倍。Chinachoti等研究发现,SepPak C8对NisinZ来说是说是最好的吸收装置。在间歇发酵系统中同时采用SepPak C8和微滤,发酵液可以在筒上渗透,并循环回到发酵桶;促进生产菌株的生长,提高Nisin产量(见表2)。多孔硅土化合物也可以也可以用于从发酵培养基中吸附Nisin,用微粒凝胶E.吸附的效果最好。被吸附的Nisin仍然保持了活力而且可以用0.1%的十二(烷)基钠硫酸盐解吸附,纯化达110-130倍。Boyaval等人曾报道了一种简单的两步纯化的方法,这个系统主要是利用相分离和阳离子交换树脂上吸附-解吸来纯化。首先在上层清液加入2%的洗涤剂,使Nisin在洗涤剂相富集;第二步在阳离子交换树脂上吸附;最后用0.7 mol/L NaCl洗提,得到的Nisin纯度达95%。