花生四烯酸发酵动态代谢通量分析模型
2007-10-21 22:04:15   来源：化学与生物工程   评论：0 点击：

　　花生四烯酸(Arachidonic acid,AA)属于ω-6系列长链多不饱和脂肪酸,具有多种生理活性[1~3],应用广泛[4]。微生物发酵法生产AA的研究主要集中在培养基的优化[5]、菌种的筛选[6]和关键酶[7]等方面,同时氮源充足条件下碳源限制发酵过程动力学模型也已建立[8],但花生四烯酸发酵过程的定向调控一直是个难题。代谢通量分析(MFA)[9]通过量化细胞体内的代谢流获得代谢通量分布图,为明确细胞内代谢过程、产物合成过程提供了可能。鉴于高山被孢霉在氮源受限制发酵时AA产量比氮源充足时高[10],同时目前大部分发酵过程都采用限制性氮源发酵[5,11],作者在此建立了氮源与碳源双底物限制动力学模型,并进一步根据代谢通量分析理论构建了花生四烯酸动态代谢通量分析模型,拟为定向调控发酵过程提供依据。
1　实验
1·1　菌种和培养基
高山被孢霉ME-1(Mortierella alpineME-1),南京工业大学代谢工程实验室保存。种子培养基(g·L-1):葡萄糖60 ,酵母膏5·0,KH2PO43·0,pH值6·0。发酵培养基(g·L-1):葡萄糖60,酵母膏5·0,KH2PO43·0,MgSO41,NaNO33,pH值6·0。
1·2　发酵工艺
用5 mL无菌水将活化斜面菌种洗入装有50 mL种子培养基的250 mL三角瓶中,25℃、150 r·min-1下摇瓶培养2 得种子液,接入5 L发酵罐进行发酵。发酵条件:温度26℃,搅拌转速250 r·min-1,装液量3 L,通气量2·0 L·min-1,pH值6·0。
1·3　分析方法
糖浓度的测定:SBA生物传感分析仪测定。菌丝体干重的测定:将培养物抽滤,并用蒸馏水洗涤3次。抽干后,60℃烘干至恒重(含水量在4%以下),称重。菌油的提取:索氏提取法提取粗菌油。脂肪酸测定:参见文献[12]。菌体碳、氮元素含量的测定:利用EA1112元素分析仪测得菌体(不含油脂)中的碳含量为41%、氮含量为5%。发酵液氮元素的衡算:发酵液氮浓度=发酵液起始氮浓度-菌体干重×5%
2　双底物限制动力学模型的构建
花生四烯酸限制氮源发酵曲线如图1所示(所提到的菌体量都是扣除油脂后的)。从图1可知,菌体生长存在一个迟滞期,菌体生长加快氮源消耗也迅速加快着氮源的基本耗尽菌体也停止生长,表明氮源浓度是影响菌体生长的限制性基质。在菌体生长阶段(0~9h)葡萄糖基本是充足的,同时其它条件(如溶氧等)对菌体生长影响不大。而到了稳定期(96~144 h)葡萄糖浓度成了限制脂肪酸合成的因素。基于以上分析,建立模2·1　氮源受限制菌体生长及氮源消耗动力学模型的构建选择氮源为影响菌体生长的唯一限制性基质,考虑到菌体浓度的增加对自身生长的抑制作用及生长存在迟滞期,采用Bergter[13]模型并略加修正,建立如下生长动力学模型:
dcx
dt=μm
(cs1-a)
Kscx+cs1(1-e-t/tL)cx(1)
由于氮源只用来合成菌体,因此氮源消耗动力学模型可用下式表示:
dcs1
dt=-0·05×dcxdt(2)
2·2　碳源消耗动力学模型及受碳源浓度限制的油脂生成模型
由于迟滞期、指数生长期葡萄糖充足而稳定期葡萄糖成为脂肪酸合成的限制条件,为更准确地描述脂肪酸的合成及葡萄糖的消耗,对迟滞期、指数生长期与稳定期分别用模型描述。用Luedeking和Piret[14]模型来描述葡萄糖的消耗与菌体生长的关系如下:
dcs2
dt=-α1dcxdt-β1cx　(0~96 h,迟滞期、指数生长期) (3)
dcs2
dt=-α2dcxdt-β2cx　(96~144 h,稳定期) (4)
迟滞期、指数生长期葡萄糖充足,对脂肪酸合成的限制性影响不大,并且脂肪酸的合成与菌体生长部分偶联,因此用L-P方程描述这个时期脂肪酸的合成:
dcp
dt=bdcxdt+dcx(5)
稳定期菌体生长基本停止,脂肪酸的合成相当于一个酶催化转化过程,且此阶段葡萄糖浓度对脂肪酸合成有限制性作用,因此选择Michaelis方程描述此过程:

3　基于动力学模型的动态代谢通量分析模型
3·1　代谢通量模型的构建
高山被孢霉体内AA合成代谢网络见图2。在高山被孢霉菌体内,用于合成脂肪酸的NADPH由苹果酸酶(Malic enzyme)脱羧作用即“转氢酶循环”提供[10]。

根据拟稳态假设,代谢中间物的积累为零,因此整个代谢途径碳流的去路可用化学计量反应式表示,从而构成了AA发酵代谢通量的分析模型。
(1)经过EMP+TCA循环完全氧化的碳流:r1: 6CO2+12NADH+4ATP-C6H12O6=0
(2)丙酮酸-草酰乙酸-苹果酸-丙酮酸循环“转氢酶循环”:
r2:-ATP-NADH+NADPH=0
将消耗的NADH和ATP折算成完全通过EMP+TCA循环消耗的碳流,则r2可表示为:

3·2　基于动力学模型的动态代谢通量分析模型的构建
指数生长期及稳定期脂肪酸组成及生成各脂肪酸所消耗的NADPH见表1。经衡算脂肪酸中各时期碳含量基本都为76%。对以上代谢通量模型做碳元素衡算得:

4·3　代谢流量分布探讨
通过动态代谢通量分析模型计算得到菌体发酵过程典型生长期第48 h的r1~r4速率,归一化后得到代谢流分布图(图5)。从图5很明显地可以看出,要提高脂肪酸的产量就得调控代谢流在菌体生长、三羧酸循环和脂肪酸合成中的分配,在保证细胞正常运转的情况下将流入三羧酸循环的代谢流降到最低,而将流入脂肪酸合成的代谢通量调至最高。因此如何限制三羧酸循环的活性、引导代谢流向脂肪酸合成迁移是调控花生四烯酸发酵的重点。

5　结论
建立了氮源与葡萄糖双底物限制动力学模型,在此基础上结合代谢流分析理论提出了花生四烯酸发酵动态代谢通量分析模型,并通过非线性最小二乘法合获得参数。该模型能很好地模拟发酵过程,并且能很容易地获得不发酵时间的代谢流分布,为指导花生四烯酸发酵调控、探讨代谢网络刚柔节点以及探究代谢机理提供了依据。