轮梗霉高产花生四烯酸的诱变育种研究
2007-05-09 09:53:48   来源：食品科学   评论：0 点击：

花生四烯酸(arachidonic acid，简称ARA或AA)为5,8,11,14-全顺-二十碳四烯酸，分子式为C20H32O2，它是通过ω-6系列的脱氢酶由亚油酸转化而来的，为ω-6系列的多不饱和脂肪酸。在高等动物中，因缺乏相关的酶，不能自身合成花生四烯酸。然而其对于人体却有着不可获缺的功能[1]，特别是对婴儿的发育非常重要[2]。花生四烯酸的自然来源主要有动物肾上腺、肝脏、沙丁鱼以及鸡蛋黄等，但其含量均很低，且易受气候、产地等环境条件的影响，且纯化成本极高，不能满足社会的需求，同时，动植物的养殖业和种植业日已饱和，因此多渠道开发其他油脂资源就成为必然。本实验室自淡水中分离到一株具有产花生四烯酸、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)等多不饱和脂肪酸能力的水生低等真菌，经初步形态学鉴定为卵菌门霜霉目腐霉科的轮梗霉(Diasporangium sp.)。之前对该菌发酵产花生四烯酸的培养条件进行了一系列的研究[3]，但离工业化生产花生四烯酸还有一定的距离，因此尝试从诱变育种角度对其进行研究，以期提高其花生四烯酸的产量。

紫外线是非电离辐射的物理诱变剂，设备简单、操作方便、诱变效果显著，因此是实验室首选的诱变用方法。对于花生四烯酸高产菌的筛选，我们选取了低温和乙酰水杨酸两种方法。一般认为能产生多不饱和脂肪酸的真菌可以在较低的温度下生长，因为细胞膜中的多不饱和脂肪酸越多，膜的流动性越好，从而能抵抗冷的环境，因此低温筛选成为筛选花生四烯酸高产菌的常用方法[4]；Vane[5]报道，乙酰水杨酸会抑制花生四烯酸的生物合成，筛选对乙酰水杨酸的抗性菌株，可以增加花生四烯酸的产量。

1材料与方法

1.1菌种轮梗霉(Diasporangium sp.)      本实验室分离纯化并保藏。

1.2培养基活化培养基：PDA固体培养基；产孢培养基：胡萝卜琼脂斜面[6]；孢子培养液：MgSO4·7H2O，KH2PO4各150mg，KCl 60μg，Ca(N03)2400mg，蒸馏水1000ml；筛选用培养基：用100ml无水乙醇溶解12片含25mg乙酰水杨酸的阿斯匹林肠溶片；以1%、2%、3%、4%、5%乙酰水杨酸母液的量加到PDA培养基中，即乙酰水杨酸的终浓度分别达到0.03、0.06、0.09、0.12、0.15mg/ml；种子及发酵培养基    PDA液体培养基。

1.3培养条件

1.3.1产孢条件将保藏菌种转接到PDA平板活化5d，用打孔器打孔后，转接一块菌丝到胡萝卜琼脂斜面上，30℃光照12h，25℃黑暗12h，不加孢子培养液培养1d，第2～5d每天更换一次10ml孢子培养液。

1.3.2孢子萌发条件取0.2ml第6d时的孢子培养液涂布PDA及添加不同浓度乙酰水杨酸的PDA培养基，在相应温度条件下培养。

1.3.3发酵产脂条件将菌种转接到PDA斜面，25℃生长3d，倒入无菌水，刮取菌丝，转接入种子培养基，25℃，120r/min发酵培养3d，以10%的接种量接种到20%装液量的发酵培养基中，相同条件培养5d。

1.4诱变处理将第6d时的孢子培养液倒入30ml0.75%生理盐水中，捣散混匀后，各取5ml于7cm直径的平皿中，在离15W紫外灯30cm处照射一定时间进行紫外诱变，然后各取0.2ml涂布PDA平板，在黑暗中培养24h后，取出培养至菌落萌发彻底。

1.5生物量测定用烘干的滤纸过滤培养5d的菌丝，以蒸馏水洗涤三次，将收获的菌丝于100℃2h烘干后称重，得到的干菌丝重量折算成生物量。

1.6脂肪酸测定及分析方法具体操作参见文献[3]。花生四烯酸产量用标准物添加法[7]，以硬脂酸作为添加物来进行定量。

2结果与分析

2.1紫外照射时间的确定

以15、30、60、90、120s对孢子进行紫外诱变处理，孢子萌发后数萌发菌落数，以计算紫外线对轮梗霉的杀菌率，结果见图1。在诱变育种工作中，目前比较倾向于采用较低的剂量，如采用杀菌率为70%～75%。因此本实验确定之后的紫外诱变用照射时间为1min，其对孢子萌发的抑制率为72.73%。2.2乙酰水杨酸筛选浓度的确定分别取0.2ml孢子培养液涂布含有乙酰水杨酸的PDA平板，27℃培养。待孢子萌发彻底后计算乙酰水杨酸对菌落萌发的抑制率，结果见图2。最终确定以含0.09mg/ml乙酰水杨酸的PDA作为筛选培养基，对经过1min紫外照射的孢子进行诱变筛选。

2.3筛选突变株以低温作为筛选条件：用诱变处理过的孢子培养液涂布PDA平板，24h黑暗、15℃培养。24h后从黑暗中取出培养至菌落萌发彻底。萌发菌落外形大致分为两类：致密和松散。挑取长势较好的菌株，将挑取的菌株编号为：LT1.n，“LT”代表低温筛选，“1”代表第一代诱变处理，“n”，代表挑取的各菌落，随n的增加大致表示这批挑取的菌落的一个从“大、致密”到“小、松散”的排序。将挑取的菌株经发酵后测定生物量，并甲酯化后测定其花生四烯酸的产量。经过紫外诱变和低温筛选出来的菌株的脂肪酸成分没有发生变化，花生四烯酸产量还是有一定的提高，而且经过低温处理，生物量有一定的提高，菌丝的生长状态也有所改善。从生物量的提高程度来看， LT1.20的效果最好，生物量提高了19.66%，花生四烯酸产量也提高了14.21%；而从花生四烯酸产量的提高幅度来看，LT1.12的效果最好，花生四烯酸产量提高了46.41%，其生物量仅提高了6.74%(表1)。以乙酰水杨酸作为筛选条件：用1min紫外照射处理过的孢子培养液涂布含有0.09mg/ml乙酰水杨酸的PDA平板，24h黑暗、27℃培养，之后不避光培养。待孢子萌发彻底，挑取其中长势较好、菌落单独存在的菌株，编号A1.n,其中“A”代表筛选用培养基为含0.09mg/ml乙酰水杨酸的PDA，“1”代表第一代诱变处理，“n”代表挑取的各菌落。将各菌株接种发酵培养后测定其生物量和花生四烯酸产量。利用乙酰水杨酸对花生四烯酸合成的抑制作用，筛

选到的各菌株的生物量都有所提高，用气相色谱测定了这些菌株的花生四烯酸含量，其中有50%的正变率，其中A1.3、A1.9、A1.12和A1.13菌株的花生四烯酸产量分别比出发菌株提高了22.55%、36.58%、42.64%和53.15%，表现出优良的花生四烯酸生产能力(表1)。从脂肪酸的组成(表2)来看：用低温筛选对花生四烯酸产量提高的原因主要是增加了脂肪酸中不饱和脂肪酸，特别是多不饱和脂肪酸的含量；而用乙酰水杨酸筛选使花生四烯酸产量提高的原因则更多的是促进了脱饱和酶的活力，参考文献中并没有指出乙酰水杨酸是花生四烯酸合成途径中哪个酶的抑制剂，但由A1.13菌株的脂肪酸组成来看，乙酰水杨酸最为可能影响的是催化双高亚麻酸(dihomo-γ-linolenic acid, DGLA)向花生四烯酸转变的△5脱饱和酶。更多的双高亚麻酸用于合成花生四烯酸了，同时又需要维持双高亚麻酸含量的相对稳定，则只有更多地从亚麻酸(γ-linolenic acid, GLA)合成双高亚麻酸，因此进而影响到的是合成双高亚麻酸的底物——亚麻酸的含量，从而A1.13菌株表现出亚麻酸含量急剧下降，而花生四烯酸含量有很大提高。另外可以看出：轮梗霉对双高亚麻酸的需求相对稳定，而对亚麻酸的需求则可以根据情况有较大幅度的波动，菌株以花生四烯酸作为最终产物，虽然我们通过气质联用证实该菌ω3途径中除了α亚麻酸(α-linolenic acid, ALA)和EPA，中间没有其它产物，其EPA可能通过ω3脱饱和酶作用由花生四烯酸脱饱和而成(未发表)，但可能EPA只是为了满足特定的功能，而不会过量积累，亦或是ω3脱饱和酶能力有限。结合LT1.12和A1.13菌株花生四烯酸产量的提高幅度及对它们脂肪酸组成的分析，我们认为乙酰水杨酸对于轮梗霉花生四烯酸高产菌的筛选针对性更强，是一种更为有效的筛选条件。2.4传代稳定性实验以花生四烯酸产量提高幅度最大的A1.13菌做传代稳定性实验。取斜面保藏菌种，每隔3d连续传代10代后，取原种和第2、4、6、8、10代的斜面同时转接发酵，然后检测其生物量及花生四烯酸产量(表3)。实验结果表明A1.13菌株花生四烯酸产量提高这一性状的改变是基因决定的，是可以稳定遗传的。

3讨  论

就一般微生物而言，突变率往往随剂量的增加而提高，但达到一定程度后，再提高剂量反而会使突变率降低。根据对紫外线、X射线和乙烯亚胺等诱变剂诱变效应的研究结果发现，正变较多地出现在偏低的剂量中，而负变则较多地出现于偏高的剂量中，因此，在诱变育种工作中，目前大家比较倾向于采用较低的剂量，如采用杀菌率为70%～75%，甚至更低(30%～70%)的相对剂量。因此本实验选取对孢子萌发抑制率为72.73%的紫外照射时间(1min)进行进一步的诱变育种。而乙酰水杨酸的浓度则最终确定为以含0.09mg/ml乙酰水杨酸的PDA作为筛选培养基，对经过1min紫外照射的孢子进行诱变筛选。脂质是微生物细胞表面结构——细胞膜的组成成分，脂质分子中不饱和脂肪酸的含量越高，其在低温条件下细胞膜的流动性也就越大，也即是微生物能生长存活的温度也越低，因此低温筛选成为筛选不饱和脂肪酸高产菌的常用方法。本实验证实：通过低温筛选只是筛选到了菌体脂肪酸中不饱和脂肪酸含量提高的菌株，而对于筛选特定脂肪酸高产菌株的针对性不是很强，只能作为一种辅助的筛选条件。

乙酰水杨酸会抑制花生四烯酸的生物合成，筛选对乙酰水杨酸具有抗性的菌株，可以提高花生四烯酸的产量。1996年Eroshin[8]利用含0.84g/L乙酰水杨酸的培养基选择性的筛选到了产花生四烯酸的被孢霉菌株，并获得三株油脂中花生四烯酸含量超过40%的被孢霉菌株。本实验也证实，利用乙酰水杨酸的筛选作用能很好的筛选到花生四烯酸产量提高的菌株。通过紫外诱变处理，用含乙酰水杨酸的培养基培养，我们筛选到A1.13菌株，其花生四烯酸产量较出发菌株提高53.15%，而且这一性状是稳定可遗传的。而且通过分析A1.13菌株的脂肪酸组成，我们还推测乙酰水杨酸抑制的是花生四烯酸合成途径中催化双高亚麻酸向花生四烯酸转变的△5脱饱和酶，这样对于花生四烯酸高产菌的筛选便有很强的针对性。但一轮或是一种方式的诱变筛选对所需产物产量的提高只能起到一定的作用，因此在以后的实验中需要对这一轮筛选到的效果较好的菌株进行再一轮或几轮的诱变，或不同方式的诱变，也可以将低温和乙酰水杨酸的筛选作用结合起来，以起到更好的筛选效果。