产脱落酸真菌的筛选及其发酵条件研究
2007-11-05 09:17:36   来源：沈　阳　化　工　学　院　学　报   评论：0 点击：

　　脱落酸(abscisic acid,ABA)是一种以异戊二烯为基本单位的酸性倍半萜类物质,是植物5大类天然生长调节物质之一.脱落酸在植物生长发育过程中起到抑制种子发芽、控制胚胎的发育与成熟、参与植物对环境逆因子的应答、诱导休眠、促进器官衰老与脱落等重要作用,在农业生产方面显示出广阔的应用前景[1-2].由于植物体中脱落酸含量极低,从中提取不可行.人工合成的外消旋型脱落酸是天然型和非天然型脱落酸的混合物,不仅价格昂贵,而且生理活性低[3].此,脱落酸是惟一未被广泛应用于农业生产的天然植物生长调节物质.近年来,利用微生物发酵生产脱落酸受到关注.研究发现,某些真菌发酵产生的脱落酸具有纯度高、生理活性强等优点,微生物发酵法成为公认具有广阔发展前景的脱落酸生产方法[4-6].然而,目前已知的脱落酸产生菌大多产量低,生产成本高,未能形成商品化生产规模.因此,筛选高产脱落酸产生菌具有重要意义.
1　材料和方法
1.1　材　料
PDA培养基(g/L):马铃薯200,葡萄糖20琼脂20.马丁-孟加拉红培养基(g/L):蛋白胨5,葡萄糖10,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0.5,琼脂201/3 000孟加拉红溶液100 mL.添加链霉素0.03 %.
种子培养基:PDA培养基不加琼脂.发酵培养基(g/L):葡萄糖20,KCl 0.5MgSO4·7H2O 0.2,CaCO35,KH2PO40.8,维生素B10. 01,谷氨酸单钠盐3, FeSO4·7H2O0.000 5,ZnSO4·7H2O 0.000 25,CuSO4·5H2O0.004.白尖叶莴苣种子,四川种都种业公司
1.2　方　法
1.2.1　样品采集和真菌分离
由沈阳化工学院附近蔬菜大棚、沈阳和平广场绿化林地和沈阳农业大学等地采集土壤样品20份及植物病叶2份.样品分别研碎、无菌水梯度稀释后涂布于马丁-孟加拉红培养基平板,27℃培养3~5 d,挑取真菌单菌落接种于PDA培养基保藏.
1.2.2　发酵培养及发酵液处理
将分离出的各株真菌孢子一环接种于种子培养基中,28℃、150 r/min培养3 d,制备液体种子.再按照1∶25的比例接入发酵培养基中,250 mL摇瓶装液量为50 mL,28℃、150 r/min培养7 d.将发酵液115℃灭菌30 min,滤去菌体及杂质[7].
1.2.3　脱落酸产生菌的初筛
分别取15 mL各菌株的发酵液加入铺有滤纸的培养皿中,将流水浸泡4 h、新洁尔灭溶液预处理过的莴苣种子播种在纸床上,每皿20粒,15~20℃保温7 d,观察发酵液对莴苣种子出芽的抑制情况,并与脱落酸标准液抑制莴苣种子发芽的生物测定结果做对比,粗略判断脱落酸的产量.与用清水培养的种子做对照[8].精确配制质量浓度为0.01、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L的ABA标准液,分别取15 mL各发酵液进行发芽实验.
1.2.4　脱落酸产生菌的复筛
将抑制莴苣种子发芽率较高的真菌的发酵液分别稀释1倍、2倍、5倍、8倍、10倍,进行发芽率测定,根据抑制莴苣种子发芽情况进行脱落酸产生菌的复筛.
1.2.5　脱落酸产生菌培养条件的优化
根据资料中影响脱落酸产量的因素,利用L9(34)正交实验对培养基配方中葡萄糖、维生素B1及谷氨酸单钠盐的添加量进行优化(见表1).

1.2.6　ABA标准液质量浓度与吸光度的关系曲线
配制1 g/L脱落酸标准溶液进行硅胶GF254薄层层析,点样量分别为8,12,16,29,28μL,展开剂为甲苯∶乙酸乙酯∶冰醋酸(10∶6∶0.8).展开后刮下脱落酸斑点,定量乙酸乙酯洗脱,在26nm处测定紫外吸收值.对数值进行回归整理
得到回归曲线为:Y=0.020 55X+0.023 88,相关系数r=0.999 8.取发酵液10 mL与等体积丙酮混合,过滤除杂质,再加入20 mL的乙酸乙酯萃取,留上层酯相,在261 nm处测定紫外吸收值.
1.2.7　脱落酸应用效果
取白菜种子做发芽实验,检测本研究制备脱落酸与脱落酸标准品对白菜种子发芽率的影
响.
1.2.8　菌种鉴定
将菌株NX-53进行平板点接培养和载片培养,观察菌落特征和分生孢子头的形状及载玻片上生长物的显微特征,根据真菌鉴定手册鉴定该菌株的种属.
2　结果与分析
2.1　菌株筛选结果
从分离出的57株真菌中初筛出4株脱落酸产生菌TX-44、SX-24、NX-53和SX-41,分别将上述菌株的发酵液稀释,检测对莴苣种子发芽抑制情况,结果见表2.

 

从表2可见,将发酵液稀释10倍时,菌株NX-53发酵液处理的莴苣种子的发芽率仍为0,表明NX-53的脱落酸产量最高,所以,对菌株NX-53产脱落酸的条件进行优化.
2.2　菌株NX-53产脱落酸条件的优化结果
菌株NX-53产ABA特性正交实验结果的极差分析如表3所示.

　　根据极差R的大小排出各因素作用的主次顺序为C>B>A,即谷氨酸单钠盐>维生素B1>葡萄糖,说明该菌株对谷氨酸单钠盐质量浓度的改变反应敏感,维生素B1添加量对发酵单位有一定影响,对葡萄糖质量浓度改变的反应低于谷氨酸单钠盐和维生素B1.由各列K′值可见,所研究因素的水平中A3B3C2为最佳组合,即优化后的培养基和培养条件为葡萄糖25 g/L,维生素B112.5 mg/L,谷氨酸单钠盐3.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/LKCl 0.5 g/L,CaCO35 g/L,KH2PO40.8 g/LFeSO4·7H2O 0.5 mg/L,ZnSO4·7H2O 2.5 mgL,CuSO4·5H2O 4 mg/L,250 mL摇瓶装液量5mL,28℃,150 r/min培养7 d.按照该培养条件进行验证实验,菌株NX-53的脱落酸产量可达276 mg/L.与一些国内学者的研究结果比,该菌株液态发酵脱落酸的产量较高,但与梁研及日本专利技术的产量尚有差距[9-11].由于菌株NX-53是野生型菌株,可以通过诱变育种等方法进一步提高其产量.
2.3　脱落酸对白菜种子发芽的抑制作用
本研究制备的脱落酸及脱落酸标准品对白菜种子发芽的影响情况见表4.由表4可见,本研究制备的脱落酸与标准脱落酸相比对白菜种子发芽率的抑制情况基本相同,表明本研究制备的脱落酸活性较高.

2.4　菌种鉴定结果
菌株NX-53在培养初期菌落呈白色,菌落外观呈绒状.在培养5 d时,菌落开始出现同心环,中心部分凸起,表面孢子成熟,呈黑色.培养7 d时,菌落直径约为3 cm,梗基有分枝,且分枝较紧密.分生孢子梗粗糙,单生的分生孢子梗占优势.鉴定为黑曲霉.
3　结　论
通过初筛和复筛,筛选出一株产ABA的真菌菌株NX-53,优化后的培养基配方和培养条件为:葡萄糖25 g/L,维生素B112.5 mg/L,谷氨酸单钠盐3.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.2 g/L,KCl0. 5 g/L, CaCO35 g/L, KH2PO40. 8 g/L,FeSO4·7H2O 0. 5 mg/L, ZnSO4·7H2O 2. 5mg/L,CuSO4·5H2O 4 mg/L, 250 mL摇瓶装液量50 mL,28℃,150 r/min培养7 d.优化条件下菌株NX-53的脱落酸产量可达276 mg/L.