应用不同方法测定阿维菌素发酵液中的总糖含量
2007-11-13 19:28:35   来源：本站原创   评论：0 点击：

　　在抗生素的发酵中需要准确、快速的测定发酵液总糖或还原糖的含量,以便了解发酵过程中总糖或还原糖的消耗情况。目前,测定发酵液总糖一般有费林定糖法、高锰酸钾滴定法和3, 5-二硝基水杨酸比色法。费林定糖法始于四十年代[1, 2],至今仍见于我国的工厂和实验室,是传统的测糖方法;高锰酸钾常用于酒精类饮料含量的测定。这两种方法属于一般的化学分析方法,影响因素多,且操作繁琐。在测定阿维菌素发酵液中的总糖时,为探讨更加有效的测定方法,笔者等选用3, 5-二硝基水杨酸比色定糖法(DNS法),其操作简便,速度快,测定结果直显示并可有数据记录储存,客观因素对其影响较少。
1　材料
1.1　试剂
3, 5-二硝基水杨酸试剂(DNS试剂):取结晶苯酚6. 9 g溶于15. 5 ml氢氧化钠溶液中,并用水稀释至69 m,l在此溶液中加6. 9 g亚硫酸氢钠,所得溶液为甲液;称取酒石酸钾钠255 g置300 ml10%氢氧化钠溶液中,再加入1% 3, 5-二硝基水杨酸溶液880ml,所得溶液为乙液;将甲、乙两溶液混合即得黄色试剂,贮于棕色瓶中,在室温放置7-10 d后使用。6 mol/l的盐酸溶液。10%氢氧化钠溶液。葡萄糖标准溶液:浓度为1. 0 mg/m,l配置前将葡萄糖于98-100℃烘箱中烘至恒重。
1.2　仪器
SP721型分光光度计(上海分析仪器厂)。
1.3　阿维菌素发酵液的制备
从阿维链霉菌代谢起始,以每24 h取适量阿维菌素发酵液于离心管中, 3 500 r/min离心15 min,取上清液备用。
2　方法
2.1　DNS法测定阿维菌素发酵液中的总糖
2.1.1　葡萄糖标准曲线的制定　取无水葡萄糖置100℃
烘箱内干燥至恒重,准确称取100 mg葡萄糖于100 ml容量瓶中定容,配成1 mg/ml葡萄糖标准溶液,按表1加入试剂。每一步操作均须将试剂混匀,沸水浴中加热5 m in,冷却至室温,用蒸馏水定容至25 m,l摇匀, 520 nm波长测吸光度。

2.1.2　阿维菌素发酵液中总糖的水解　取发酵上清液0.25 ml置于50 ml容量瓶中,加6 mol/l的盐酸溶液5 m,l蒸馏水10 m,l在沸水浴加热15 m in,取出1-2滴置于白瓷板上,加

 

碘-碘化钾溶液1滴,检查是否水解完全,如已水解完全,则不呈现蓝色,水解完毕,冷却至室温,后加酚酞指示剂1滴,
以6 mol/l氢氧化钠溶液中和至微红色,并定容至50 ml[3]。
2.1.3　阿维菌素发酵液中总糖的测定　取总糖水解液2 m于25 ml容量瓶中,加入DNS试剂5 m,l沸水浴5 min,冷水冷却后定容至25m,l以空白作对照测定520 nm波长下的吸光度。
2.1.4　不同DNS试剂加入量的阿维菌素总糖含量　在测定总糖的过程中,仅改变DNS试剂的加入量,即分别为0. 5 ml、1. 0 ml、1. 5 ml、2. 0 ml、2. 5 ml、3. 0 m,l测定阿维菌素发酵液中总糖。
2.1.5　不同测定波长的葡萄糖标准曲线　在测定总糖的
过程中,将葡萄糖显色液分别在486 nm、520 nm、540 nm、570 nm波长下测定葡萄糖含量,得出葡萄糖的标准曲线及相关系数。
2.1.6　不同显色时间的阿维菌素总糖含量　在测定总糖的过程中,仅改变DNS试剂与还原糖(发酵液中被水解的总糖)反应的时间(显色时间),即分别为1 m in、2 m in、3 m in、4 m in、5min、6min、7min和8min,测定阿维菌素发酵液中的总糖。
2.2　费林定糖法测定阿维菌素发酵液中的总糖
取费林氏甲、乙液各5 ml放入150 ml锥形瓶中[4],加入10 ml蒸馏水及1ml被还原的总糖样品稀释液,再用糖滴定管加入比预备滴定少0. 5 ml的1%葡萄糖溶液,摇匀加热至沸30 s后匀速滴入葡萄糖液,标准液至蓝色或紫色消失即为终点。
2.3　高锰酸钾滴定法测定阿维菌素发酵液中的总糖
取适量处理样品溶液于400 ml烧杯中,加入碱性酒石酸钾钠甲、乙液各25 m,l盖上表面皿,置电炉上加热,使其在4 m in内沸腾,再准确沸腾2 min,趁热抽滤,并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀,至洗液不呈碱性反应为止。将坩埚放回
原400 ml烧杯中,加25 ml硫酸铁溶液及25 ml水,用玻璃棒搅拌,使氧化亚铜完全溶解,以高锰酸钾标准溶液滴定至微红色为终点。记录高锰酸钾标准溶液消耗量。同时吸取50 ml水代替样液,按上述方法做试剂空白试验[5]。
3　结果
3.1　标准曲线
标准溶液系列吸光值测定结果见表2。

　　根据以上测定结果得回归方程Y=14. 023 8X-0. 027 3。方程中Y为吸光值, X为溶液中葡萄糖含量,相关系数r=0·998 6,标准曲线见图1。

3.2　阿维菌素发酵液中的总糖含量的变化
测出发酵液总糖含量的吸光值后,根据标准曲线的回归方程计算出总糖稀释液的浓度X值,从而可知发酵液中总糖含量(见表3),总糖含量(g/ml)=10 X%。

　　阿维菌素发酵液中的多糖主要是糊精,经水解后其含量从表3可以看出,在发酵起始,总糖含量迅速下降,到第3天时,下降速度逐渐减慢。当发酵过程的条件不变、参数一定时,这一曲线变化的规律适合于任何一株阿维菌素产生菌灰色链霉菌的糖代谢变化。
3.3　DNS添加量对阿维菌素发酵液中总糖测定的影响
在实验条件下,DNS添加量对发酵液总糖影响结果见表4。

从表4可以看出,随着DNS添加量的增加,发酵液显色液的吸光度变化不大,有逐渐增加的趋势。这可能是由于
DNS添加量的增多使其吸光度增大的缘故[6]。DNS添加量主要与待测发酵液的还原糖含量有关。一般在阿维菌素发酵液的总糖测定时,DNS添加量为1. 5ml较适宜。
3.4　测定波长对阿维菌素发酵液中总糖测定的影响
在分光比色分析测定时,一般选定最大光吸收值作为测定波长,这样可获得最大灵敏度。但在总糖的测定过程
中,不同的研究人员所选择的波长有所不同。本研究用紫外可见分光光度仪比较了波长对葡萄糖的光吸收的影响,在可见光范围内,显色液在486 nm处有较大吸收,并分别在486 nm、520 nm、540 nm、570 nm波长下测得葡萄糖的标准曲线以及相关系数,结果见表5。

3.5　DNS与糖显色时间对总糖测定的影响
DNS在碱性、沸腾的条件下与糖类化合物的碱性基团发生反应并显色。DNS与还原糖显色后,其色泽深浅的比例可作为还原糖测定的依据。在实验条件下,DNS与还原糖反应并显色,显色(煮沸)时间对还原糖的测定有很大影响。表6为显色时间对还原糖测定的影响。

从表6可以看出,显色时间在3 min内显色液的吸光度随显色时间的延长而增加。3 min后,吸光度随时间变化不
大。尤其在5 min之后,显色后的吸光度已基本趋于稳定。所以,一般取DNS与还原糖反应的显色时间为5 min。
3.6　显色稳定性实验
加入显色剂后,放置12 min,吸光度达到最大且恒定,还原糖与显色剂反应生成橘红色溶液至少在10 h内保持稳定。
3.7　费林定糖法、高锰酸钾滴定法和3, 5-二硝基水杨酸比色法检测阿维菌素发酵液中总糖含量的比较同时用3种方法测定同一菌株代谢一个周期的发酵液的总糖含量变化,结果见表7。
表7　3种测定方法的相对误差和标准误差值

4 讨论

4.1　从表3发酵液总糖含量变化趋势可以看出,阿维菌素发酵液中的总糖消耗一开始急剧下降,说明阿维链霉菌生长代谢旺盛,以恒定速度进行分裂增殖,数量增加,初级代谢产物生成;第3天后,糖消耗速度减慢,代谢产物蓄积,阿维链霉菌繁殖速度下降,死亡数逐步上升,次级代谢产物、毒素等大多此时产生,这反映了微生物的生长繁殖过程。因此在阿维菌素的生产过程中[7],由于阿维链霉菌生长代谢的需要,需及时调整发酵罐内营养物质的比例,往发酵罐内补料是必不可少的,是提高阿维菌素产量的主要措施之一,所以及时准确的测定发酵液总糖含量,可监测到发酵是否正常进行,以更好的控制发酵过程,掌握发酵参数,从而优化发酵条件,使发酵向正常的、有利的方向进行,最终使效价大幅度提高。
4.2　运用DNS法时,酒石酸钾钠在DNS试剂中的作用是防
止溶解氧的侵入;苯酚的作用是增加DNS显色后的颜色深度,以及平衡脲形成时对糖测定的影响;亚硫酸氧钠与苯酚配合使显色后颜色更加稳定,碱性环境是DNS与还原糖作用的条件。从表4看出,在测定发酵液总糖含量时,当DNS添加量大于1. 5 ml时,对结果的影响虽然不大,但浪费大,当小于1. 5 ml时,还原糖过量,使得测定结果偏低,所以应选择DNS添加量为1. 5 ml。测定波长对总糖的测定也有很大影响,从表5看出,不同波长下所得的标准曲线和相关系数存在着差异。波长越短,其标准曲线的相关系数偏离1的数值越大;随着波长的增加,这种偏离程度变小。这可能是在486 nm波长下测定时[8],存在最大光吸收,所以灵敏度最高;但在此波长下测定,所测得的数据稳定性差。相关系数偏离1的数值趋大。在570 nm下测得的数据,虽然稳定性好,但灵敏度偏低,为兼顾两者, 520 nm是在最大光吸收的波长和灵敏度最低的波长中间,既能获得较高的灵敏度,且所测得的数据稳定性又较好。因此在总糖测定过程中,一般取520 nm为测定波长。另外,要把握和控制煮沸时间、DNS显色后存放时间等因素。
4.3　在测定阿维菌素发酵液总糖含量时,从以上费林定糖法、高锰酸钾滴定法和3, 5-二硝基水杨酸比色法测定方法看,其差异性都不显著。在发酵前期,测定结果基本一致,在发酵后期,特别是总糖含量很低时,费林定糖法准确度较差。表7正反映了这一特点,即在这3种方法中,费林法的相对误差和标准误差值最大,用比色法测定就准确得多。
费林溶液与还原糖之间的反应受到溶液酸碱性、加热温度、搅拌力度、蒸发量、滴定速度以及副作用等参数影响,滴定终点的判断,人为影响因素较大,费林法测定更加不准确,高锰酸钾法也存在这个问题。而DNS法应用的分光光度计操作简单,测定准确,测试成本低,简化了测定程序,节约了试剂,同时也减少了滴定误差,避免了费林法中亚甲蓝的氧化问题,而且准确度和重现性也较好。通过以上实验研究表明,采用比色法测定发酵液中总糖含量,速度快、结果准确,是较理想的方法之一。