产谷肤甘肤重组巴斯德毕赤氏酵母发酵条件的研究
2007-10-15 23:20:35   来源：本站原创   评论：0 点击：

谷胧甘肤(GSH)是由L--谷氨酸、L-半胧氨酸和甘氨酸缩合而成的一种含有y一谷氨酞基和琉基的生物活性三肤，具有多种重要的生理功能。微生物发酵法是目前生产GSH最常用的方法，选用的菌种多为酵母。
1980年代以来，随着基因工程技术的发展，在利用基因工程技术构建高产GSH的重组菌株方面的研究受到越来越多的重视，主要是采用基因重组技术GSH合成的2个关键酶基因gshl和(或)gshn隆到微生物细胞中进行高效表达，以达到提高GSH产量的目的〔‘一5〕。研究室前期曾对产GSH的酵母菌进行了筛选和初步的鉴定困，克隆了来源于酿酒酵母的GSH合成关键酶基因gshl，并构建了重组巴斯德毕赤氏酵母(PichiaPastoris)x--33(pGApZA一邵入1)。本研究即在此基础上对该重组菌进行了发酵条件优化。在摇瓶条件下，考察重组毕赤氏酵母的培养基及培养条件，选择理想的培养基和培养条件，以期通过提高重组菌的生物量达到提高GSH积累量的目的。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1菌株
巴斯德毕赤氏酵母尸ichiapastori:x一33购自Invitrogen公司，重组酵母Pichiapastori:x--33(pGAPZA一gshl)为研究室构建。
1.1.2培养基
YEPD培养基(g/L):葡萄糖20，蛋白陈20，酵母膏10，自然pH。固态培养基加人琼脂209/L。平板保存及活化培养基:采用YEPD培养基。种子培养基及初始发酵培养基:采用YEPD培养基。
1.2实验方法
1.2.1种子活化
从保存于4℃冰箱的斜面上取1环重组酵母Pic人iaPastori:x--33(pGAPZA一gshl)，在YEPD平板上划线培养Zd,培养温度为30℃。
1.2.2种子培养
从活化Zd的平板上挑一单菌落，接人装有20mLYEPD液体培养基的250mL三角瓶，300C、200r/min培养24h，作为种子液。
1.2.3发酵
将种子液按10%接种量接种到装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，30℃、200r/min培养56h，测细胞干重(DCW)及GSH含量。
1.2.4分析方法
1.2.4.1酵母菌体生物量的测定取一定体积发酵液3soor/min离心5min，水洗2次，收集菌体，85℃烘干至恒重，称量。
1.2.4.2胞内谷胧甘肤含量的测定
利用ALLOXAN试剂衍生化法测定胞内GSH的含量，测定方法参考文献「7]。
2结果与讨论
2.1重组酵母Pichiapastorisx一33(pGAPZA-gshl)初步发酵实验
按上述方法挑取新鲜平板上的单菌落接种到YEPD种子培养基培养24h后，在液体YEPD发酵液中发酵。重组酵母GSH产量及生长曲线如图1所示，在发酵48h时，细胞生物量达到最大积累，但是GSH积累还未停止。发酵56h时，GSH含量达到最大的积累为42.2mg/L，约是宿主菌的1.6倍。因此选择发酵时间为56h。

2.2发酵培养基的优化
2.2.1破源的选择
分别选择209/L葡萄糖、甘油、蔗糖、可溶性淀粉、玉米粉作为碳源，其余成分采用YEPD培养基配方，发酵56h后测定生物量及GSH含量，结果表明，在以甘油为碳源的培养基上，重组毕赤氏酵母的生物量及GSH含量均达最高值。实验中进一步研究了甘油浓度对重组毕赤氏酵母合成GSH的影响。分别配制109/L、209/L、25g/L、309/L、409/L、509/L的甘油，其他成分同YEPD培养基配方，以10%接种量、300C、ZOor/min进行发酵培养，56h后测定重组毕赤氏酵母生物量及GSH的含量，结果发现，当甘油浓度达309/L时，生物量及GSH含量均达最高值分别为18.169/L和71.2mg/L。
2.2.2氮源对重组酵母发酵的影响
2.2.2.1蛋白脏浓度的影响
在以上试验的基础上，考察了不同浓度的蛋白陈(5一509/L)对重组毕赤氏酵母生物量及GSH合成的影响。结果发现，蛋白陈浓度为259/L时生物量达到最大值为20.19/L，而GSH积累量在蛋白脉浓度为409/L时达到最大，为77.2mg/L。
2.2.2.2无机氮源的影响
随后考察了不同浓度的(NH4)2504、NH;CI和尿素对重组毕赤氏酵母合成GSH的影响。实验结果表明，这3种无机氮源的添加对GSH的合成没有明显的促进作用，因此不在发酵培养基中添加额外的无机氮源。
2.2.2.3酵母膏的影响
以上述试验为基础，考察了不同浓度的酵母膏对重组毕赤氏酵母发酵生产GSH的影响。结果表明，在。一129/L浓度范围内随着酵母膏浓度的提高，生物量呈上升趋势，超过99/L，GSH含量逐渐趋于稳定，达到77.3mg/L。
2.2.3前体氨基酸对重组酵母发酵的影响
酵母细胞中GSH是由谷氨酸、半胧氨酸和甘氨酸3种前体物质在GSH合成酶的作用下合成的。因此在上述实验的基础上，在培养基中分别添加2mmol/L的GSH前体氨基酸:谷氨酸(0.299/L)、半胧氨酸(0.249/L)、甘氨酸(0.159/L)。结果发现，3种前体氨基酸对重组毕赤氏酵母的生物量都有一定的抑制作用，但同时发现，添加半胧氨酸对GSH的合成有明显促进作用，GSH的终浓度最高可达88mg/L。因此，以后的试验在发酵培养基中添加终浓度为0.249/L半胧氨酸。
2.2.4KHZPO峨浓度对重组酵母发酵的影响
磷是蛋白质和核酸组成的必要成分，磷的浓度对菌体的生长和外源蛋白的表达也有很大的影响。在上述实验基础上，考察了不同浓度的KHZPO;对重组毕赤氏酵母的生物量及GSH合成量的影响。结果表明，当KHZPO;浓度为59/L时，重组毕赤氏酵母的生物量和GSH的积累量均达到峰值，分别为19.29/L和95.1mg/L。
2.2.5正交试验优化培养基组成
在单因素实验基础上，通过L。(3“)正交试验，选择甘油浓度、半胧氨酸浓度、KHZPO、浓度3种培养基组分作为考察对象，进一步优化培养基组成。其因素水平的选择见表1，实验设计方案参考文献「8]，结果见表2。
 

从表2中GSH含量的极差可以看出，甘油、半胧氨酸和KHZPO;三个因素对GSH产量的影响程度大小依次为:甘油浓度>半胧氨酸浓度>KH:PO、浓度，最优组合为AZB3Cl，即甘油309/L，半胧氨酸0.369/L，KHZPO;39/L。此条件下，重组酵母GSH产量为98.5mg/L，生物量为19.49/L。

2.3发酵条件的优化
在上述优化后的培养基的基础上，考察培养条件对重组毕赤氏酵母GSH含量及生物量的影响。
2.3.1初始pH的影响
首先考察初始pH的影响，结果发现，当初始pH6.0时，生物量和GSH含量都能保持在较高的水平。由于培养基的原始pH6.2左右，因此在实验中对培养基的初始pH不作调整。
2.3.2摇床转速的影响
在以上实验的基础上，研究了摇床转速分别为160r/min、180r/min、ZOor/min和220r/min对菌体产GSH的影响，发酵结束后测定GSH含量，结果表明最佳转速为20or/min。
2.3.3装液量的影响
将培养好的种子液分别接人装有20mL、30mL和50mL的发酵培养基的250mL三角瓶中，其他条件不变，结果表明最佳摇瓶装液量为30mL/250mL。
2.3.4接种量的影响
将培养好的种子液分别按3%，5%，10%，15%和20%的接种量接人发酵培养基中，其他条件不变，结果表明10%接种量条件下菌体生物量和GSH产量均达到最高。
2.4优化后重组菌的发酵过程曲线
以优化的培养基和培养条件接种发酵，每隔sh取样，测定其生物量、残留甘油及GSH积累量，64h发酵结束，发酵过程曲线如图2所示。
2.5SL发酵罐上重组菌的发酵特性
根据正交实验优化结果，确定在SL发酵罐上的
发酵培养基组成为:甘油309/L、蛋白陈409/L、酵
母膏99/L、半胧氨酸0.369/L、KHZPO;39/L。结
果表明，在SL发酵罐上的发酵过程与摇瓶中发酵过
程曲线基本吻合，GSH产量最大值达到了97.9mg/
L，生物量达到最大值为18.79/L。
3结论
目前以发酵法生产GSH存在出发菌株GSH产量不够高等问题，利用基因工程技术将微生物细胞中GSH合成的关键酶基因在合适的宿主细胞进行高表达获得高产GSH工程菌是解决该问题的主要策略之一。Fan等曾将来源于酿酒酵母GSH合成途径的限速酶y一谷氨酞半胧氨酸合成酶的编码基因gshl克隆到载体pGMF中，并成功转化到酿酒酵母YSF-31中，重组菌的GSH含量是宿主细胞的1.5倍，达到13.1mg/g(干细胞重)[s〕。实验在摇瓶水平上，考察了碳源、氮源、磷酸盐和前体氨基酸等对重组巴斯德毕赤氏酵母PichiaPastorisx--33(pGAPZA一gsh
1)合成GSH的影响，优化了培养基成分和培养条件，并在此基础上进行了SL发酵罐研究。发酵结束
后，重组菌GSH产量、生物量分别为97.9mg/L，18.79/L，与摇瓶发酵结果基本吻合，为进一步利用
工程菌生产GSH提供了新途径。