酿酒酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸工艺的优化
2009-04-20 22:52:25   来源：本站原创   评论：0 点击：

摘  要：目的  优化酿酒酵母LS101发酵生产S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的工艺。方法  用单因素实验法，通过测定SAM浓度、细胞浓度、胞内SAM含量以及胞外SAM浓度等参数来确定较为适合的工艺。结果  得到适合的培养基组成为：蔗糖10 %～12 %，L-甲硫氨酸0.4 %，尿素1.5 %～2 %，酵母粉3 %，甘氨酸0.1 %，生物素4 mg/L。8 L发酵罐间歇分批补料发酵，培养54 h后SAM产量为3.9 g/L，细胞浓度达到42.2 g/L。结论  得到了优化的酿酒酵母LS101生产SAM发酵工艺，提高了SAM发酵水平。
关键词：S-腺苷甲硫氨酸；酿酒酵母；发酵工艺优化；分批补料发酵
中图分类号：TS261.1+1           文献标识码：A          文章编号：1672-979X(2008)01-0013-05

Optimization of S-adenosylmethionine Fermentation Process by  Saccharomyces cerevisiae
LI Hai-jun, ZHU Xi-qiang*, LIU Cai-xia, GUO Xue-ping, LING Pei-xue
（Shandong Academy of Pharmaceutical Science, National Glycoengineering Research Center, Jinan 250108, China)
Abstract ：Objective To optimize S-adenosylmethionine(SAM) fermentation process by Saccharomycs cerevisiae LS101. Methods The fermentation process was optimized by single factor experiment. The fermentation parameters including SAM concentration, cell concentration, SAM content and extracellular concentration of SAM were measured in order to choice a better fermentation process. Results A medium containing 10 %～12 % of sucrose, 0.4 % of L-methionine, 1.5 %～2 % of urea, 3 % of yeast extract powder, 0.1 % of glycine and 4 mg/L of biotin was found to be suitable for SAM production. A fed-batch fermentation process was conducted in a 8 L fermentor. The SAM concentration could be up to 3.9 g/L after the cultivation for 54 h and the maximal cell concentration was 42.2 g/L。 Conclusion An optimal fermentation process for SAM production can be achieved and the level of SAM fermentation can be improved.
Key words：S-adenosylmethionine; Saccharomyces cerevisiae; fermentation process optimization; fed-batch fermentation

           图1  蔗糖浓度对SAM发酵的影响

由图1可见， 蔗糖浓度6 %～12 %的范围内，SAM浓度和胞内SAM含量逐渐增加，12 %时到达最高[1.56 g/L和0.118 g/g（DCW）]，胞外的SAM浓度也较高。蔗糖浓度继续升高，SAM合成量开始下降，可能是较高的糖浓度抑制了甲硫氨酸腺苷转移酶的活性。酵母利用蔗糖的速度较快，48～72 h时，所有发酵液中残留的蔗糖已少于5 g/L。因此，选用10 %～12 %的糖浓度较适宜。
3.2  L-甲硫氨酸浓度
ATP和L-甲硫氨酸经酵母胞内的甲硫氨酸腺苷转移酶催化合成SAM。预实验表明，发酵液中不添加前体L-甲硫氨酸则酵母胞内基本不积累SAM，故 L-甲硫氨酸是必需的前体。设定L-甲硫氨酸发酵液浓度为0.3 %，0.5 %，0.7 %，0.9 %，1.2 %，其他条件如3.1。摇瓶发酵96 h，结果见图2。

         图2  L-甲硫氨酸浓度对SAM发酵的影响

由图2可见，SAM积累浓度随着发酵液中L-甲硫氨酸浓度的增加呈明显下降的趋势，从2.11g/L减至1.61 g/L；胞内SAM含量也呈相同的变化，从0.144 g/g DCW降至0.112 g/g DCW，但胞外SAM浓度和细胞浓度基本无变化。表明过高的L-甲硫氨酸浓度对甲硫氨酸腺苷转移酶有明显的抑制作用，导致SAM合成减少，因此应适当减低L-甲硫氨酸浓度。实验表明，L-甲硫氨酸浓度0.3 %～0.5 %较适宜，一般选用0.4 %，既不会明显抑制SAM合成，也能积累较高浓度的SAM。
3.3  尿素浓度
酿酒酵母发酵SAM，可用尿素部分替代蛋白胨等有机氮源。设定尿素浓度为0.5 %，1.0 %，1.5 %，2.0 %，2.5 %，蔗糖浓度为12 %，其他条件同3.2。摇瓶发酵96 h，结果见图3。
由图3可见，尿素浓度1.5 %～2.0 %时，SAM浓度、胞外SAM浓度，胞内SAM含量以及细胞浓度均达到最大值，故选用1.5 %～2.0 %。

          图3  尿素浓度对SAM发酵的影响

3.4  酵母粉浓度对SAM发酵的影响
预实验表明，增大酵母粉浓度对SAM发酵影响较大。设定酵母粉浓度为1 %，2 %，3 %，4 %，5 %，同时延长发酵周期至144 h，发酵的其他条件见3.3。结果见图4。

         图4  酵母粉浓度对SAM发酵的影响

由图4可见，酵母粉浓度对SAM的合成有很大的影响。酵母粉浓度从1 %增至3 %时，SAM浓度从1.70 g/L 提高到3.47 g/L，增加了104.1 %；细胞浓度由14.06 g/L提高到30.17 g/L，增加了114.6 %；胞内SAM含量基本无变化，而胞外SAM浓度急剧减少，可能是因营养充足，细胞死亡破碎较少，这对于SAM后提取工艺有重要意义。但酵母粉浓度从3 %增至5 %时，细胞浓度基本没有变化，同时SAM浓度和胞内SAM含量均呈下降趋势。故选用3 %酵母粉浓度。发酵液中的蔗糖在48 h时已全部耗尽，此时分析发酵液中乙醇浓度较高。至发酵结束时，乙醇浓度逐渐减少。
3.5  4种有机氮源
3.4实验中使用的Oxoid酵母粉价格较高，难以用于大规模生产。因而选用2种常用的工业级蛋白胨、工业级酵母粉以及二者搭配与Oxoid比较，添加量均为3 %，其中工业级YE+工业级PEP为1.5 %+1.5 %。其他发酵条件同3.4。摇瓶发酵144 h，结果见图5。

         图5  4种有机氮源对SAM发酵的影响

                               YE: 酵母粉，PEP: 蛋白胨

由图5可见，Oxoid酵母粉的发酵结果略好于其他3种有机氮源（3.29 g/L vs 3.0 g/L），细胞浓度以及胞内SAM含量也稍高，但差别不大。工业级蛋白胨与Oxoid最为接近。考虑成本控制，可用工业级酵母粉或蛋白胨。
3.6  甘氨酸浓度
Shozo等[11]发现，添加甘氨酰甘氨酸能提高SAM产量，但成本太高，故用甘氨酸替代。设甘氨酸添加浓度为0.0 %，0.1 %，0.2 %，0.4 %，0.6 %，其他发酵条件同3.4。摇瓶发酵144 h，结果见图6。

         图6  甘氨酸浓度对SAM发酵的影响

由图6可见，添加0.1 %甘氨酸，SAM的浓度从2.98 g/L提高至3.54 g/L，胞内SAM含量从0.101提高至0.114，胞外SAM浓度也较低。甘氨酸浓度大于0.1 %时，SAM浓度反而小幅下降。添加甘氨酸对酵母细胞生长基本没有影响，故选用0.1 %甘氨酸浓度。
3.7  生物素浓度
生物素是酵母生长代谢过程必需的生长因子。初始发酵液中生物素的浓度分别为0，2，4，6，8 mg/L。生物素单独过滤除菌，接种前添加。其他发酵条件同3.6。摇瓶发酵144 h，结果见图7。

         图7  生物素浓度对SAM发酵的影响

由图7可见，添加一定量的生物素后，SAM浓度和细胞浓度都有小幅升高，生物素浓度4 mg/L时SAM浓度最高（3.6 g/L）；而胞内SAM含量和胞外SAM浓度变化不大。因而选用4 mg/L生物素浓度。
3.8 8 L发酵罐间歇分批补料的情况

  图8  8 L发酵罐上间歇分批补料时SAM的发酵情况

在上述实验基础上，以8 L发酵罐间歇分批补料发酵。补料策略为：尽量降低蔗糖和L-甲硫氨酸对SAM合成酶的抑制，分批定时补加蔗糖和L-甲硫氨酸。蔗糖补加过程为：发酵液初始蔗糖40 g/L，分别于8，16，24 h补加40，50，50 g/L，蔗糖用量总计为180 g/L；L-甲硫氨酸补加过程为：发酵液L-甲硫氨酸4 g/L，分别于16，24，30 h补加1.5，1.5，1.5 g/L， L-甲硫氨酸总计用量为8.5 g/L。其他发酵条件见2.1与3.7，发酵72 h，实验结果见图8。
由图8可见，SAM的生成与细胞的生长呈正相关，SAM浓度随细胞浓度对数的增加而增加。蔗糖补完约12 h后（36 h时），细胞浓度达到最高（42.2 g/L），细胞生长到达稳定期，直至发酵结束；细胞生长到达稳定期后SAM合成并未停止，其浓度继续缓慢增加，在48～54 h时达到最高（3.9 g/L），胞内SAM含量最高为0.098 g/g（DCW）。每次补加的蔗糖在6 h内消耗完；气相色谱分析发酵液上清，乙醇浓度达5 %。蔗糖耗尽后，酵母可利用乙醇，所以SAM合成延续了20 h以上。胞外SAM浓度随发酵进程缓慢增高，补糖结束后增速明显加快，发酵结束时达0.95 g/L，表明补充的营养成分不足，酵母生长受抑制，死亡细胞增多。与摇瓶发酵相比较，发酵罐发酵周期显著缩短，由96～144 h减至48～60 h；SAM产量由3.6 g/L提高至3.9 g/L；细胞浓度由32 g/L提高至42.2 g/L。但是发酵罐上胞内SAM含量较低，而胞外SAM浓度高，这需要进一步优化设计补料策略。  
蔗糖除合成细胞外，大量转化成乙醇，蔗糖耗尽后酵母会继续利用乙醇。有研究者发现控制发酵液中乙醇浓度对SAM合成有很重要的影响，故可从控制发酵液中乙醇浓度上改进补料过程。因SAM在酿酒酵母细胞内的代谢是一个复杂的网络，涉及胞内ATP和L-甲硫氨酸含量，以及合成和降解SAM的各种酶，在一般的培养基条件下难以在胞内积累高浓度的SAM。需精细控制培养基中各物质的浓度，才能让主要代谢流向SAM合成方向走。因此，需对SAM合成的代谢流作更深的研究。
4  结论
在摇瓶条件下优化酿酒酵母LS101发酵生产SAM工艺，得到适合发酵SAM的培养基组成为：10 %～12 %蔗糖，0.4 % L-甲硫氨酸，1.5 %～2 %尿素，3 %酵母粉，0.1 %甘氨酸，4 mg/L生物素。优化后SAM产量从1.6 g/L提高到3.6 g/L，提高显著。8 L发酵罐间歇分批补料发酵生产SAM，培养54 h后SAM产量为3.9 g/L，细胞浓度最高达到42.2 g/L，均较摇瓶高。发酵罐上发酵周期显著缩短，由摇瓶的96～144 h减至48～60 h。

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