国产和进口培养基发酵培养重组人SOD工程菌的比较研究
2007-09-07 12:57:58   来源：中国医药生物技术   评论：0 点击：

采用以进口酵母粉和胰蛋白胨配制而成的LB培养基对所构建的重组基因工程菌的目的蛋白表达及发酵条件进行优化是目前常用的方法[1-6]。进口的酵母粉和胰蛋白胨质量优异，在配制中澄清、不出现沉淀，营养成分充足，对于实验研究而言非常方便，但其价格昂贵，不适于基因工程菌后期的放大规模发酵培养和生产。为了在降低基因工程菌发酵培养成本的同时，又使外源基因能够高水平表达，以提高表达蛋白的产量，我们自行构建的基因重组人超氧化物歧化酶（rhSOD）工程菌，利用国产廉价酵母浸出汁和蛋白胨配制而成的LB培
养基进行发酵培养，并进行培养条件优化研究，同时与进口产品配制的LB培养基相比较，探讨以国产材料替代昂贵的进口酵母粉和胰蛋白胨的可行性，为rhSOD进一步规模化生产降低发酵成本提供实验依据。
1材料与方法
1.1主要材料
1.1.1仪器Model 250/2.5电泳仪为美国Bio-Rad公司产品，HZQ-X100振荡培养箱、HZQ-F160全温振荡培养箱为国哈尔滨市东联电子技术开发有限公司产品，WFJ 2100可见分光光度计为UNICO上海仪器有限公司产X6USB扫描仪为上海中晶电脑有限公司产品。
1.1.2试剂进口胰蛋白胨和酵母粉为英国Oxoid公司产品，国产蛋白胨为天津市被联精细化学开发有限公司产品，国产酵母浸出汁为上海天鹅啤酒有限公司产品；氨苄青霉素（Amp）为石家庄制药集团产品，丙烯酰胺为加拿大BBI公司产品，N，N-亚甲基双丙烯酰胺为美国Sigma公司产品，三羟甲基氨基甲烷为厦门Sanland-chem公司产品，甘氨酸为美国Sigma公司分装产品，其他试剂皆为国产分析纯。
1.1.3培养基
1.1.3.1进口LB培养基（A培养基）进口胰蛋白胨10 g/L，进口酵母粉5 g/L，氯化钠10 g/L，以氢氧化钠调pH为7.2~7.4，分装灭菌，使用时加入Amp（终浓度为100μg/ml）。
1.1.3.2国产LB培养基（B培养基）国产蛋白胨10 g/L，国产酵母浸出汁5 g/L，氯化钠10 g/L。配置时出现絮状沉淀，静置，倾出上清，无需调pH，分装灭菌，使用时加入Amp（使终浓度为100μg/ml）。
1.1.4菌种含重组质粒pTK-rhSOD的基因工程菌E.coli DH5α为本研究室构建和保存。
1.2方法
1.2.1种子液培养取100μl保藏菌种接种于10 ml A培养基中，于37℃摇床（200 r/min）过夜培养（约14~16 h），即为种子液，用于转接培养。
1.2.2 rhSOD表达的检测rhSOD工程菌种子液经转接A和B培养基并生长至所需菌体密度后，取出1 ml菌体（离心留菌泥）作为未诱导对照，然后于42℃诱导表达一定时间后，取样0.5 ml，离心留菌泥。在对照菌泥和表达菌泥中分别加入1×SDS还原样品液50和100μl，混匀后置沸水中煮5 min，轻微离心后取20μl样品，行12%SDS-PAGE，以X6USB扫描仪扫描电泳凝胶，采用Bio-Rad 1D凝胶蛋白含量测定软件（从Bio-Rad主页免费下载）测定rhSOD表达的相对百分含量。
1.2.3菌体接种量对rhSOD表达的影响将过
夜种子液分别以1%、2%、3%、4%和5%接种量接种于A和B培养基中，不同时间测各个接种量在波长600 nm处的吸光度（A600）值，当A600=0.4~0.6时，分别转至42℃摇床，于2000 r/min诱导表达4 h，各取样0.5 ml，离心留菌泥，以SDS-PAGE检测rhSOD的表达，确定最适菌体接种量。
1.2.4菌体生长密度对rhSOD表达的影响种
子液按1.2.3确定的最适接种量分别接种于A和B培养基（各15个10 ml）中，于37℃摇床
（200 r/min）培养，每隔15~20 min分别测得其A600值后，立即转入42℃摇床，200 r/min分别诱导培养4 h，各取样0.5 ml离心，取菌泥以SDS-PAGE检测rhSOD的表达，确定最适菌体生长密度。
1.2.5诱导时间对rhSOD表达的影响种子液按1.2.3确定的最适接种量，待菌体生长至1.2.4确定的最适A600值时，转移至42℃摇床，分别于200 r/min振荡培养诱导1、2、3、4、5、6、7和8 h，各取样0.5 ml，离心留菌泥，以SDS-PAGE检测rhSOD的表达，确定最佳诱导时间。
1.2.6 Amp浓度及加入时机对rhSOD表达的影响取7个各装有10 ml A培养基的三角瓶（预先加入100μg/ml的Amp 10μl），编号1~7。设1号瓶为对照，其余分为2组。2~4号为一组，先分别补加Amp 5、10、15μl，使其终浓度分别为150、200和250μg/ml，然后按2%接种量分别接种种子液，去振荡培养，待菌体生长至所需最适A600值后，分别转入42℃摇床直接诱导表达3 h。5~7号为另一组，先按2%接种量分别接种种子液并待生长至所需最适A600值后，再分别补加Amp 5、10、15μl，使其终浓度分别为150、200和250μg/ml，然后转入42℃摇床诱导培养3 h。自7个培养瓶各取样0.5 ml离心，取菌泥以SDS-PAGE检测rhSOD的表达。另取7个各装有10 mlB培养基的三角瓶，按3%接种量分别接种种子液后，进行同样操作。
1.2.7不同装液量对rhSOD表达的影响取500 ml三角瓶，分别装入A或B培养基各50（10%）、100（20%）、150（30%）、200（40%）ml，采用上述确定的最适条件进行rhSOD工程菌培养和诱导，并设未诱导对照。分别取样0.5 ml，离心取菌泥以SDS-PAGE检测rhSOD的表达。
1.2.8诱导温度对rhSOD表达的影响
按上述确定的最适条件将菌体培养至最适生长密度时，分别在42、43、44、45℃条件下诱导表达3 h，各取样0.5 ml，离心取菌泥以SDS-PAGE检测rhSOD的表达。
2结果
2.1菌体接种量对rhSOD表达的影响结果见图1。对于A培养基而言，1%和2%接种量时rhSOD表达量最大，2%~5%接种量时则随着接种量的增加，rhSOD的表达量逐渐减少。对于B培养基而言，接种量对rhSOD的表达无
明显影响。
2.2菌体生长密度对rhSOD表达的影响
结果见图2。使用A培养基，当菌体生长至A600值达0.55~0.93时开始诱导，rhSOD的表达量相对较高；使用B培养基，当菌体生长至A600值达0.38~0.63时开始诱导，rhSOD的表达量相对较高。

2.3诱导时间对rhSOD表达的影响结果见图3。对于A培养基，诱导2~4 h，rhSOD的表达量较高，4 h后随着表达时间的延长，表达量反而逐渐降低。对于B培养基，诱导时间在3~5 h目的蛋白的表达量最高，诱导时间大于5 h后，目的蛋白的表达量有所降低，但降低幅度不大。
2.4 Amp浓度及加入时机对rhSOD表达的影响结果见图4。使用A培养基，在开始诱导前补加一定量的Amp，较之接种前补加一定量Amp和按常规剂量加入Amp，更有助于rhSOD表达量的增加，且在诱导前补Amp5μlAmp终浓度由100μg/ml提高至150μg/ml，目的蛋白表达量最高。使用B培养基，在诱导前补加Amp 10μl使Amp终浓度由100μg/ml提高至200μg/ml，较之接种前补加一定量Amp，可得到更高表达量的目的蛋白。
2.5不同装液量对rhSOD表达的影响结果见图5。与通常的装液量（20%）相比，在同样容积的三角瓶中，无论使用A和B培养基，低装液量和高装液量（从10%~40%）对rhSOD的表达均没有明显的影响。
2.6诱导温度对rhSOD表达的影响结果见图6。使用A培养基，42℃和43℃时rhSOD表达量基本相同，之后表达量随诱导温度的升高而降低。使用B培养基，诱导温度在42~44℃时对rhSOD的表达影响不大，45℃时
表达量稍低。
2.7进口和国产LB培养基对rhSOD表达诱导效果的比较在相同LB培养基配制条件下，采用上述优化的发酵条件分别进行基因rhSOD工程菌的发酵培养，即A培养基采用2%接种量，菌体密度生长至A600值达0.55~0.93，诱导前补加Amp由初始的100μg/ml至150μg/ml，于42~43℃诱导2~4 h；B培养基采用3%~5%接种量，菌体密度生长至A600值达0.38~0.63，诱导前补加Amp由初始的100μg/ml至200μg/ml，于42~44℃诱导3~5 h。结果显示，无论使用A还是B培养基，目的蛋白rhSOD的表达量均可达到30%左右（图7）。

3讨论
从接种量对rhSOD表达的影响结果可知，对于A培养基，接种量小，菌体生长的迟滞期延长，A600值达0.4~0.6的时间延长；接种量过大，菌体密度A600值达到0.4~0.6的时间虽然缩短了，但菌体生长代谢速率不一致，导致表达量的下降。综合考虑，选择2%接种量较为适合。对于B培养基，目的蛋白表达量整体区别不大，即接种量对rhSOD表达的影响不明显。但接种量越小，菌体生长至对数期所需的时间越长，从节省时间和能源考虑，采用3%~5%接种量较为适合。从菌体密度对rhSOD表达的影响结果可知，使用A和B培养基都有一个表达蛋白收率较高的菌体密度（A600值）范围。低于此值诱导，菌体未达到最适生长状态，因而表达量减少；而高于此范围，即诱导太迟，在体积有限的发酵液中菌体过度生长，势必造成表达时营养成分的严重不足，从而影响目的蛋白的正常表达。然而A和B培养基的最适A600值又有不同，使用B培养基，最适A600值为0.38~0.63，高于0.63则不能得到较高表达；使用A培养基，最适A600值为0.55~0.90，这可能是由于二者的营养成分不同所造成。A培养基营养成分稍高一些，使对数期延长，故其最适A600值也相应偏高；而B培养基因其在配制过程中出现一些絮状沉淀，由于干扰菌体密度测定而被静置除去，造成营养成分偏低，使得A600值在0.90左右时菌体生长已达稳定期，菌体密度已不再增加，继续培养，菌体发生自溶，目的蛋白表达量进而下降。但在A600值为0.38~0.63范围内诱导，目的蛋白的表达量却没有降低，与使用A培养基在A600值0.55~0.90时诱导的表达量持平，均占菌体总蛋白的30%左右，表明营养成分的减少并未影响目的蛋白rhSOD的表达量。
从诱导时间对rhSOD表达的影响结果可知，使用A培养基选择表达时间2~4 h较为适合，使用B培养基选择表达时间3~5 h较为适合。随诱导表达时间的延长，目的蛋白表达量减少，其原因可能是部分菌体发生自溶，也可能是诱导产生的包含体在菌体蛋白酶长时间的作用下发生了降解。对于一些易被水解的抗生素，添加抗生素造成的选择压力只能维持一定的时间[7]。在培养过程中Amp易分解失效，若没有足够剂量的抗生素，基因工程菌的重组质粒很容易丢失。不带质粒的宿主菌在低抗生素或无抗生素的环境下大量生长，携带质粒的重组菌和不含质粒的宿主菌混合生长，目的蛋白表达量必然会下降。补加小剂量的Amp后维持了培养基中Amp浓度，有效抑制了质粒丢失，有利于重组菌目的蛋白的高表达。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与，般而言，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢[8]。然而我们构建的rhSOD工程菌对通气量却不敏感，这非常有利于放大培养和今后的规模化生产。
使用国产的酵母膏和蛋白胨配制培养基时，往往溶解度较差，培养基浑浊不澄清，有时还会出现絮状沉淀，使得培养基的营养成分降低，质量远不及研究初期阶段所使用的进口酵母粉和胰蛋白胨。培养基营养成分的差异会使基因工程菌的生长受到影响，进而导致目的蛋白表达量有所不同。然而进口酵母粉和胰蛋白胨相对于国产材料价格昂贵，在后期大规模发酵生产时使用进口产品成本太高因此我们想到能否通过培养条件的优化来实现使用国产材料配制培养基而获得与进口培养基一样的目的蛋白表达量。本研究中我们对利用国产LB培养基发酵培养rhSOD工程菌的最适条件进行了探索。结果显示，使用国产LB培养基，当采用3%~5%的接种量，菌体密度A600在0.38~0.63之间，升温诱导表达前补加Amp使其终浓度为200μg/ml，于42~44℃诱导3~5 hrhSOD的表达量可达到30%左右，与使用进口LB培养基的结果相当。这表明对于发酵培养rhSOD工程菌言，廉价的国产酵母浸出汁和蛋白胨完全可以替代昂贵的进口产品，而国产LB培养基的成本只有进口LB培养基成本的1/7。本研究结果为rhSOD进一步规模化生产降低发酵成本提供了实验依据。