固定化玫瑰微球菌发酵产海藻糖合成酶系
2007-04-03 11:37:24   来源：北京化工大学学报   评论：0 点击：

　　Ｄ 海藻糖作为一种天然保鲜剂,可有效抑制淀粉老化、蛋白质变性、脂质氧化和微生物污染等引起食品变质[1],而且无毒无害,已被美国食品药品监督管理局和欧洲立法系统批准为一种安全的食品添加剂[2],此外,用作生物制剂的保存剂和化妆品的保湿成分等亦有良好效果[3 4]。自从能够以淀粉为原料,通过酶转化生产海藻糖以来,其价格大幅度下降,使其在各个应用领域的广泛应用成为可能。本文采用微球菌发酵产胞内酶系麦芽糖苷基海藻糖合成酶ＭＴＳａｓｅ和麦芽糖苷基海藻糖水解酶ＭＴＨａｓｅ,全细胞酶反应催化淀粉转化为海藻糖,其中发酵产酶是整个过程中关键性步骤,因此有必要对其进行更进一步的研究。利用细胞固定化技术提高细胞生长速率、活性及稳定性,实现连续培养,在国内外已有报道。对发酵产胞内酶而言,固定化发酵过程可以是一部分菌体吸附在多孔载体上,另一部分菌体随发酵液被移出,用于进行下一步酶反应。在移出发酵液的同时,不断流加新鲜培养基,从而实现连续培养,提高酶的时空产率,此方面研究在国内外鲜有报道。本文以聚氨酯为载体,考察了固定化细胞对菌体生长和产酶活力的影响,以及固定化细胞重复批次发酵效果,在摇瓶中初步探索了重复批次发酵较适宜的换液量和换液时间的基础上,在10Ｌ发酵罐中进行了放大试验。结果显示固定化不仅大大缩短了发酵周期,提高了酶的时空产率,而且简化了发酵过程,省去不断进行种子培养和接种的繁杂工作,降低了能耗。

1　材料与方法

1 1　材料

1 1 1　菌种　玫瑰微球菌为本实验室自筛选诱变而得。

1 1 2　培养基(ｇ/Ｌ)　固体培养基:可溶性淀粉20,蛋白胨10,牛肉膏5,ＮａＣｌ5,ｐＨ7 0。种子培养基:葡萄糖30,牛肉蛋白胨10,酵母浸粉5,牛肉粉3,Ｋ2ＨＰＯ4·3Ｈ2Ｏ1,ＮａＨ2ＰＯ41,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0 5,ＣＨ3ＣＯＯＮａ0 1,ｐＨ(8 0±0 5),过膜添加ＶＢ120 005%。摇瓶发酵培养基:葡萄糖20,蛋白胨5,酵母浸粉1,Ｋ2ＨＰＯ4·3Ｈ2Ｏ2,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0 5,ｐＨ(8 0±0 5)。发酵罐培养基:葡萄糖20,玉米浆50,黄豆饼粉5,Ｋ2ＨＰＯ4·3Ｈ2Ｏ2,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0 5,ｐＨ(8 0±0 5)。

1 1 3　载体　由北京恒跃海绵制品厂购得5种聚氨酯,记为Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｅ型。

1 2　实验方法

1 2 1游离细胞培养　摇瓶培养:将菌种由斜面接种到种子培养基中,装液量50ｍＬ/250ｍＬ,30℃,140ｒ/ｍｉｎ,培养20ｈ;后以10%的接种量转接于摇瓶发酵培养基中,30℃,180ｒ/ｍｉｎ,培养96ｈ。发酵罐培养:将菌种由斜面接种到种子培养基中,装液量50ｍＬ/250ｍＬ,30℃,140ｒ/ｍｉｎ,培养20ｈ;以10%的接种量转接到摇瓶发酵培养基中,30℃,180ｒ/ｍｉｎ,培养18ｈ;最终以10%接种量转接到10Ｌ发酵罐中,装液量5Ｌ,30℃,200～250ｒ/ｍｉｎ,通气量9Ｌ/ｍｉｎ,培养48ｈ。

1 2 2　固定化细胞培养　载体预处理:将聚氨酯处理成5ｍｍ×5ｍｍ×5ｍｍ的小块,用蒸馏水洗净并浸泡24ｈ,121℃灭菌20ｍｉｎ,烘干待用。固定化:将一定量经预处理的载体小块加入摇瓶或发酵罐培养基中共同灭菌后接种,进行固定化细胞培养,发酵条件与游离细胞培养相同。重复批次发酵换液:固定化细胞培养至酶活达到最大值,无菌条件下移出一定量发酵液,测定其生物量和酶活等参数,再将等量新鲜培养基加入反应器内,与剩余发酵液及固定化细胞共同继续培养,一定时间间隔后,再重复上述操作。

1 2 3　发酵参数测定　细胞质量浓度测定:细胞质量浓度(ｇ/Ｌ)采用细胞干重法。菌体于60℃烘干至恒重,精确称重。残糖浓度测定:残糖浓度测定采用ＤＮＳ[5]法,标准曲线方程为ｙ=3 526ｘ+0 0056,线性相关系数Ｒ=0 9974,其中ｘ为550ｎｍ波长下的吸光度,ｙ为还原糖浓度(ｍｇ/ｍＬ)。酶活测定:发酵液3000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,收集菌体,生理盐水洗涤2次,离心备用。将1ｇ湿菌体悬浮于5ｍＬ0 1Ｍ,ｐＨ=8的磷酸缓冲液中,经甲苯透性化处理[6]后,加入相同体积的浓度为15%的淀粉液化液,30℃振荡反应4ｈ。11000ｒ/ｍｉｎ离心2ｍｉｎ,取上清,测定海藻糖含量。海藻糖含量测定采用ＨＰＬＣ法[7 8]。高效液相色谱为日立ＬＡ 10ｖｐ型,采用ＺＯＲＢＡＸ ＮＨ2柱(150ｃｍ),柱温30℃,流动相为乙腈-水,体积比为78∶22,流速1ｍＬ/ｍｉｎ;示差折光检测器。以上各参数每个数值点测定3次,取平均值±标准偏差为最终测定结果。酶活定义为每分钟转化淀粉得到1μｇ海藻糖所需的酶量为1个酶活力单位(ｕ)[9]。酶的时空产率定义为每升发酵液发酵1ｈ产酶的酶活,单位为ｕ/(Ｌ·ｈ)。

2　结果与讨论

2 1　载体选择以相同的添加量8ｇ/Ｌ,将Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ和Ｅ5种聚氨酯经预处理后添加到培养基中,固定化细胞培养96ｈ,测定酶活。由图1可见,以Ｂ型聚氨酯为载体的固定化细胞发酵产酶的酶活最高。因此选择Ｂ型聚氨酯为固定化载体。

2 2　载体添加量选择图2为Ｂ型聚氨酯载体添加量对固定化细胞培养产酶的影响。如图所示酶活随载体添加量的变化在不同范围内呈现不同趋势,添加量小于6ｇ/Ｌ时,酶活随载体添加量的增大而升高,在6～10ｇ/Ｌ范围内酶活保持稳定,大于10ｇ/Ｌ时,酶活随载体添加量的增大而下降。从成本角度考虑,选择6ｇ/Ｌ为载体添加量。

2 3　固定化发酵与游离细胞发酵菌体生长及产酶动力学比较　　

在相同培养条件下,分别进行固定化细胞与游离细胞培养各96ｈ,考察固定化对发酵产酶的影响,结果如图3所示。其中固定化细胞载体为Ｂ型聚氨酯,载体添加量为6ｇ/Ｌ。

图3描述了固定化与游离细胞两种培养方式下细胞质量浓度、产酶活力、残糖浓度及ｐＨ随发酵时间变化的差异。由图可见,在发酵周期的前50ｈ,固定化细胞培养菌体生长速率及产酶活力明显大于游离细胞。发酵40ｈ,固定化细胞培养获得最高酶活,达到52ｕ/ｍＬ,比游离细胞培养提高了33%,固定化对细胞生长及产酶起到促进作用。这可能是由如下两方面原因造成的:一是固定化载体对细胞起到保护作用,使细胞免受高剪切力的作用,维持细胞内ｐＨ值稳定和防止酸化,限制有毒副产物的局部浓度[10];二是固定化使得培养过程中发酵液的溶氧提高了。由于大量发酵液被吸入载体内,反应器内液态部分比相同装液量条件下游离细胞培养减少了约50%,溶氧水平与较小装液量条件的发酵相当,在保证了设备利用率的前提下,为菌体呼吸和产酶提供更加充足的氧,促进菌体生长和产酶。而这种促进作用只有在适宜的固定化载体添加量范围内才能表现。如果无限制的增加载体,反应器内发酵状态将越来越趋于固态发酵,可能导致基质膨胀程度降低,菌体生长受抑制,因此图2中载体添加量超过9ｇ/Ｌ之后,酶活反而逐渐降低了。

2 4　固定化细胞与游离细胞重复批次换液效果的比较　　

分别进行固定化细胞培养和游离细胞培养,至二者获得各自最大酶活后,均以40%的换液量每隔24ｈ进行换液。由图4可见游离细胞换液培养各批次细胞质量浓度及酶活波动较大,进行5批换液后,生物量急剧下降。而固定化细胞表现出良好的稳定性,连续9批换液生物量及酶活无明显下降,且各批次发酵得到的菌体平均细胞质量浓度达到12ｇ/Ｌ,与游离细胞相比提高54%,平均酶活达到69ｕ/ｍＬ,比游离细胞培养增大了1倍。

2 5　换液条件的选择

由于各批次换液量决定了下一批发酵种子量的大小,从而影响其细胞生长及产酶速率,因此分别选择16ｈ、24ｈ两个时间间隔,30%、40%和50%三个换液量,进行重复批次换液实验,同时对换液量和换液时间两个条件进行选择。结果如图5所示。对比16ｈ＆30%和16ｈ＆40%两组条件,二者细胞质量浓度差异不大,但16ｈ＆40%各批发酵的酶活均高于16ｈ＆30%,这可能是由于16ｈ＆40%移出发酵液量较大,副产物去除较彻底,使得菌体生长及产酶受副产物的影响较小,稳定性较好。对比24ｈ＆40%和16ｈ＆40%两组条件,在24ｈ＆40%条件下,细胞质量浓度和酶活均明显高于16ｈ＆40%。这可能是由于16ｈ发酵时间过短,细胞生长时间不充分,而且从酶活与菌体生长的关系上看,酶活最高点比菌体生长达稳定时间相对滞后,因此24ｈ＆40%对产酶较有利。

对比24ｈ＆40%和24ｈ＆50%两组条件,24ｈ＆40%优于24ｈ＆50%。这可能是由于24ｈ＆50%条件下,换液量过大,部分吸附在载体内菌体随发酵液被移出,导致下一批发酵的种子量较少,因此菌体生长及产酶效果不如24ｈ＆40%。综上所述,摇瓶固定化细胞培养较适宜的换液条件为发酵40ｈ后,以40%的替换量每隔24ｈ以新鲜培养基替换发酵液,在此条件下,重复换液9批,230ｈ细胞质量浓度及酶活无明显下降。

2 6　发酵罐换液试验参考摇瓶最优载体添加量和换液条件,在10Ｌ发酵罐内进行固定化细胞重复批次发酵的放大实验,各批次菌体生长及产酶情况如图6所示。发酵罐内培养,细胞质量浓度及酶活最高分别达到17ｇ/Ｌ和80ｕ/ｍＬ,比摇瓶培养提高了40%和60%,重复换液7批,连续180ｈ细胞质量浓度维持

在15ｇ/Ｌ以上,酶活维持在60ｕ/ｍＬ以上,酶的时空产率达到56 9ｕ/(Ｌ·ｈ),比游离细胞培养单批发酵提高42 5%。

3　结论

(1)通过载体类型和载体添加量的选择,以及游离细胞与固定化细胞培养的对比发现,在一定的载体添加量范围内,固定化对菌体生长及产酶起到促进作用。(2)将固定化细胞与游离细胞培养进行重复批次换液的对比后得出结论,游离细胞稳定性差,重复批次发酵是不可行的,只有固定化才能实现重复批次发酵。(3)参考摇瓶重复批次发酵最适宜的换液条件在10Ｌ发酵罐中进行的放大实验,生物量明显高于相同条件下的摇瓶发酵,最高酶活与之相比提高60%,但平均酶活与之相当,而且只能重复换液7批,连续发酵180ｈ,不如摇瓶发酵持续时间长。因此换液条件、替换培养基的成分、ｐＨ值和搅拌转速等参数还有待优化,固定化细胞重复批次发酵产酶有望达到更佳的效果。