微生物发酵生产番茄红素的研究进展
2007-03-27 20:44:12   来源：生物技术通报   评论：0 点击：

      番茄红素是存在于自然界中的一种天然色素,呈红色,因最早发现于番茄中得名。主要存在于植物细胞的有色体中,其中番茄中含量最高,达3-14mg/100g。而美国学者最近发现秋橄榄浆果所含的番茄红素相当于番茄的1.8倍[1]。番茄红素与其他类胡萝卜素一样,动物自身不能合成。由于番茄红素没有类似胡萝卜素那样的芷香环而没有VA活性,在过去一直不被重视。然而,近年研究发现其具有优越的生理功能:在类胡萝卜素中,其抗氧化作用最强。其对单线态氧的淬灭作用是β-胡萝卜素的2倍,维生素E的100倍。同时还具有防病抗癌,增强机体免疫力和抗衰老等生理功能,在食品、化妆品以及医药领域具有重要用途,具有较高的开发和应用价值。目前世界上番茄红素的开发生产主要有天然提取、化学合成、微生物发酵等方法。以色列、日本、瑞典、瑞士、美国、法国和澳大利亚等国家以及罗氏、巴斯夫等跨国公司在此方面处于领先地位,但目前只在以色列实现了从鲜番茄中提取的商业化生产[2]。由于番茄中的番茄红素含量很低,而且天然提取法产率低且价格昂贵,无法满足需求;而化学合成法成本虽有所下降但存在一定不安全性。随着生物技术的快速发展,利用微生物发酵生产番茄红素成为目前的研究热点之一。

    1番茄红素的理化特性1903年Schundc发现番茄中提取的这种色素的吸收光谱与胡萝卜素不同,将其命名为Ly-copene。1910年Willstatler和Escher指出番茄红素是类胡萝卜素的异构体,并首次确定其分子式C40H60,分子量为536.58,含11个共扼双键及2个非共扼碳一碳双键。结晶呈暗紫色,为脂溶性色素,不溶于水,大部分为全反式构型。性质十分活泼,易受氧、紫外线、温度的影响而迅速氧化。在酸性环境和有CO2存在的条件下以及温度低于50℃的酸性条件下,色素性能稳定[3]。

    2番茄红素的生物合成异戊烯焦磷酸(IPP)作为番茄红素合成途径中第1个较为直接的前体物质,是由葡萄糖转化而来。番茄红素的类异戊二烯代谢途径合成过程详见图1。番茄红素经环化酶作用可形成多种类胡萝卜素[4]。对革兰氏阴性菌欧文氏菌代谢途径的研究发现从法呢基焦磷酸(FPP)合成番茄红素是由3个crt基因(crtE,crtB,crtI)控制[5]。

3番茄红素的微生物法生产近些年来,研究人员对利用微生物发酵生产番茄红素方面进行了大量研究,涉及微生物主要有三孢布拉氏霉菌(B1akesleatrispora)、一些基因改造的酵母菌、红色细菌及能自身合成番茄红素的革兰氏阴性非光合菌,包括萎蔫欧文氏菌(Erwiniauredovora)和草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)。下面分别以不同微生物的发酵生产研究进行简单概述。

3.1细菌红色细菌的番茄红素含量较高,但未能进行工业化生产。有一则68年专利曾报道用浅红链霉菌(Streptomycesrubescens)突变株发酵6d产番茄红素0.5g/L[6]。最近研究者分离出一分枝杆菌属野生菌株,在其产生的类胡萝卜素中有80%为番茄红素。将pH控制在非生长最适宜范围(pH6~6.4)或在培养基加入高盐(85mM氯化钠),番茄红素产量达7.4mg/g生物量[7]。革兰氏阴性非光合菌,包括萎蔫欧文氏菌和草生欧文氏菌虽然也能自身合成番茄红素,但含量较低,主要用于番茄红素生物合成代谢途径的研究[5]。之后,RoseM等利用大肠杆菌载体pA—CYCl84建立携带欧文氏菌控制番茄红素合成基因的质粒pACCRT—EIB(载有crtE,B,I),将其转入JMl01大肠杆菌后生产出200~500ug/g(DW)的番茄红素。

3.2霉菌三孢布拉氏霉菌在工业化生产中主要用于β-胡萝卜素的生产。当在培养过程中添加一些胺类和杂环氮化合物以抑制细胞内环化酶的活性时,三孢布拉氏霉菌合成大量的番茄红素[8]。不过,这种抑制机制一直是用来研究胡萝卜素生物合成途径,用于生产则较少。王永生等[9]在培养中添加三孢布拉氏霉菌合成β-胡萝卜素的前体物质(β-紫罗酮和异烟肼)之后选正确时机添加β-胡萝卜素环化阻断剂,一定程度地提高了番茄红素的产量。控制环化的另一个重要条件是pH,中性偏高有利番茄红素形成,方法是添加碳酸钠保持发酵液pH6.6以上,有关工艺已有专利申请,产量0.15g/L。Gavrilov等人[10]添加了烟草的废弃物1%于霉菌的发酵液中,经110h发酵,得到番茄红素约60~80mg/100ml。非离子型表面活性剂span-20可以改变发酵液流体特性和细胞通透性,再加上其水溶性,从而有利于细胞内外物质的传递,达到有利于番茄红素合成的条件,因而可使番茄红素生产能力提高2倍,达98.6mg/L发酵液[10]。用三孢布拉氏霉菌发酵生产技术获得的结晶番茄红素,经异丁基醋酸盐再结晶可得到高纯度的反式番茄红素[11]。

3.3酵母菌酵母菌本身并不能合成番茄红素,研究者发现酵母在生长稳定期能在体内积累的大量麦角固醇,利用麦角固醇与类胡萝卜素的生物合成途径在FPP分叉的特性,通过引入欧文氏菌crtE竞争FPP,使之部分从麦角固醇生物合成途径转向番茄红素的生物合成。1994年Shige-yukiYamano等人将生物合成番茄红素和β胡萝卜素的基因(crtE,crtB,crtI,crtY)及其启动子插入啤酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中,将该酵母菌在选择性培养基30℃培养3d。冷冻干燥离心过滤所得细胞,再加入丙酮,破碎细胞,再用丙酮萃取4次并蒸干丙酮得到番茄红素的含量为113"g/g细胞干重[12]。产蛋白假丝酵母(CandidaUtilis)也是工业生产上应用广泛的酵母菌,经常用于生产单细胞蛋白、谷胱甘肽及RNA。YutakaMiura等[13]将欧文氏杆菌控制番茄红素合成的基因转入产蛋白假丝酵母中,利用被重组基因的产蛋白假丝酵母培养生产番茄红素,每1g干重产蛋白假丝酵母可得到0.758mg的番茄红素和0.407mg的八氢番茄红素。

3.4藻类藻类中广泛地存在有类胡萝卜素,但以β-胡萝卜素最为普遍。国内外学者们在利用藻类发酵生产类胡萝卜素的生产菌株及工艺方面进行了广泛的研究,其中杜氏藻、红球藻等在国外已被批准用于商业生产类胡萝卜素[4]。结合三孢布拉氏霉菌研究,如若在藻类发酵过程中添加合适的阻断剂,阻断番茄红素到类胡萝卜素的环化途径,同样就可以积累大量的番茄红素。而利用藻类生产类胡萝卜素技术的相对成熟,转化率较高,这必将会大大促进微生物发酵生产番茄红素应用潜力。综上所述,利用基因工程和生物技术已能部分控制番茄红素合成过程中前体物质的转化方向,如使FPP竞争性地从生成麦角固醇转向番茄红素。虽然采用微生物发酵生产番茄红素技术目前未能达到工业化生产的规模,但从发展趋势来看,发酵法成本及污染相对较低,如能进一步提高菌体的贮存力和转化力,是实现工业化生产番茄红素经济而有效的途径。