纳他霉素发酵工艺探讨
2006-09-17 15:47:50   来源：不详   评论：0 点击：

       纳他霉素是一种多烯大环内脂类抗真菌抗生素,它是一种白色或乳白色，几乎无臭无味的结晶粉末。
      1982年6月，FDA正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂,成为目前国际上仅有的两种生物防腐剂之一。1997年3月，我国卫生部正式批准纳他霉素作为食品防腐剂。纳他霉素作为食品防腐剂，既可以抑制各种霉菌、酵母菌的生长，也能抑制真菌毒素的产生，并且它在较低的浓度下仍具有活性，在奶酪中的纳他霉素比山梨酸钾活性高 400 倍 。研究还表明，纳他霉素对人体器官无论是急性毒性还是慢性毒性都没有明显影响 。它在食品中的抗菌作用是双效的，既可防止真菌引起的食品腐败，又可防止真菌毒素的产生。
      目前，纳他霉素已被广泛用于食品、医疗、粮储等领域中，特别是在食品原料保鲜、成品防腐方面的应用显示了良好前景。我国应用的纳他霉素绝大部分依赖进口且价格很高，所以研究通过优化纳他霉素发酵工艺，提高纳他霉素的单位产量和绝对产量降低使用成本，扩大实际使用面已迫在眉睫。
1 材料与方法
1.1 种子与培养基
      菌种SG-56，天津科技大学实验室保藏:种子培养基（g/L）葡萄糖20，蛋白陈20，酵母粉6，NaCl10，pH7.0:发酵培养基（g/L）葡萄糖37，大豆蛋白17，酵母粉4.5，初始pH17.0
1.2 种子培养液
      将SG-56在斜面上培养7－10d，用生理盐水将斜面上的孢子洗下，孢子悬浮液的浓度大约在1O的8次方Cfu/mL，以一定的接种星，用饱子悬浮液接种于100mL/500mL增殖培养基，一定温度下摇床培养24h后成种子液。
1.3 发酵
    以一定的种子液接种发醉培养基200mL置于1000mL角瓶中，摇床培养，发醉一定时问后停止。
1.4 分析方法
    采用高效液相色谱法，采用外标法，pHenomenexprodigy 5u,  ods3 100A<250mmx4.60mm  i.d.,5um)色谱柱，以甲醇一水一磷酸(体积比85:15:0.15)为流动相，流速为1 mL/min >室温下20uL进样，纳他霉素保留时问为1.972min ，紫外检测波氏303nm。
2 结果与讨论
2.1 温度对发酵的影响
      因为微生物的生长和产物的合成都是在各种酶的催化下完成的，温度是保证酶活性的重要条件，在发酵过程中，保持相对稳定而合适的温度是必要的温度对微生物的影响还表现在其它两个方面，一方面随着温度的升高，细胞中的生物化学反应速率加快，生长速率加快；另一方面，微生物的重要组成，如蛋白质、核酸等对温度敏感。在其它条件相同的情况下，不同温度发酵的结果见 。
      从表1可知，最适发酵温度是29度。
2.2 接种量对发酵的影响
      在发酵过程中，接种量的大小与菌种的生长繁殖速度有关。采用较大的接种量，种子进入发酵液后容易适应；且种子液中含有大量体外水解酶类，有利于对原料的利用。过大的接种量往往使菌体生长过快，容易造成基质缺乏或溶氧不足，从而影响抗生素的合成；过小的接种量会引起发酵前期菌体生长缓慢，发酵周期延长，增加染菌生长机会，还会造成菌体结块等发酵异常。因此，控制好接种量也是保证发酵正常的一个关键因素。不同接种量对纳他霉素产量的影响见表2。

        由表2结果看5% 、6% 、8% 、10%的接种量的发酵瓶中发酵液的外观非常稠，造成发酵不适。4%的接种量，有利于缩短延迟期，但是大量增值的菌体极大消耗培养基中的营养物质，一定程度上造成抗分泌前期前体物质缺乏，从而不能得到较高的纳他霉素产量。1%的接种量过小，延迟期较长。因此，2%的接种量较佳。
2.3 接种种龄对发酵的影响
      种子质量高低，直接影响发酵的成败。接种种龄即种子培养时间以菌体处于生命力极为旺盛的快速生长末期，且培养液的菌体量还未达到最高峰时较为合适，此时种子浓度较大，质量较高，接入发酵液后能较快进入生长期，有利于缩短发酵周期和提高纳他霉素产出率。接种时间太早，往往出现前期生长缓慢，使发酵周期延长；接种时间太晚，由于菌体活力不够，会引起抗生素产量下降和菌体的过早衰老自溶。接种不同生长期的种子时，纳他霉素的产量见表3。

      由表3可知，培养24-26h接种时的产量较低，以26h最高，28h进行发醉的种子的产星有较明显下降。因此，培养26h左右处于迅速成长期的种子。
      微生物在进行物质代谢的同时，伴随着能量代谢。氧是微生物体内产生能量的一系列生化反应的电子最终受体，是好气微生物进行能量代谢的重要物质。因此，溶解氧是需氧发酵控制的要参数之一。但是，需氧发酵并不是溶解氧越大越好。溶解氧虽然有利于菌体生长和产物的合成，但通风量太大，菌体生长过快，会使发酵变得粘稠，反而使溶解氧下降。由纳他霉素的代谢途径可以知道，在纳他霉素初级的代谢时，需氧量较高，但是随着进入次级代谢阶段，纳霉素的合成不需要太多溶氧。因此，在发酵过程中，控制溶解氧的量，满足生产菌对氧的需要是提高发酵产量的重要因素之一。试验采用一体积的三角瓶，固定转速，改变装液量来确定最佳溶解氧。试验采用 1000ml 三角瓶，结果见表4。

       由表4可见，在摇床转速为200r/min， 1000mL份角瓶装液量确定为1OOmL时，溶解氧在30mg/L左右水平，既有利于菌体生长，又适合纳他霉素的生产。
2.5  pH对发酵的影响
      pH对微生物生氏具有非常明显的影响，是影响发酵过程中各种活性的重要囚素，井影响微生物原生质膜的改变，同时pH会对发酵液中的部分营养中问产物的离解造成影响。因此，在发酵过程中，控制适当的pH是很重要的通过大量实验，发现发酵液起始pll控制在7.9，发酵前期4hpH，保持在6.5左右，后期pH保持在5.5左右，纳他霉素的产出率较高。
3 结论
       实验结果证明，纳他霉素的发酵生产条件为温度控制在29度，接种量在2%，接种种龄控制在26h，溶解氧掌握在30mg/l.，发酵起始pH控制在7.0左右，发酵前期45hpH保持在6.5左右，后期pH保持在5.5左右，纳他霉素的产出率较高。