灭蚊真菌贵阳腐霉原生质体诱变育种实验研究
2010-10-14 22:23:38   来源：本站原创   评论：0 点击：

【摘要】 　　目的： 建立采用紫外线和氯化锂诱导灭蚊真菌发生突变的方法，为培育理想菌株开辟新的途径。方法: 对出发菌株贵阳腐霉的原生质体进行诱变处理，通过正突变率与紫外、化学诱变剂量的相互关系，确定最佳诱变条件，经过酪蛋白平板透明圈和菌粉得率粗筛突变株，连续8代传代培养及摇瓶实验检测突变株的遗传稳定性。结果: 当用0.6%氯化锂处理90 min时，突变株的致死率和正突变率分别为86.9%和26.9%；用20 W紫外灯30 cm照射180 s，突变株致死率为81.3% 、正突变率为78.5%；筛选了7株突变株，其中U22经传代实验证明其遗传性状稳定。结论: 本研究所建立的对贵阳腐霉原生质体诱变系统基本成功，为该菌的细胞工程育种创造了条件。
【关键词】 贵阳腐霉; 原生质体; 紫外线； 氯化锂; 诱变； 育种
　　［Abstract］ Objective: To establish a mutation induction system for mutation breeding of Pythium guiyangense Su, a fungal pathogen of mosquitoes. Methods: Protoplasts of original strain were treated with UV or LiCl for mutation induction. Casein plate transparent loop method and mycelial weight determine were used to screen mutant colonies. Pertinent induction condition combination were summarized based on the analysis of the relationship between the positive mutation rates and treatment dosages and periods of UV or LiCl. One of the mutational colonies was continuously cultivated for 8 generations on KPYG2 plates for the observation of genetic stability. Results: A lethal rate of 86.9% and a positive mutation rate of 26.9% were achieved when the protoplasts were treated by 0.6% of LiCl for 90mins, and a lethal rate of 81.3% and a positive mutation rate of 78.5% were obtained when the protoplasts were irradiated by a UV lamp of 20W in a distance of 30cm for 180s. Seven mutants were obtained, and one of them, U22, was proved genetically stable. Conclusions: The mutation induction system of P. guiyangense by UV and LiCl is successful, and can provide basis for the mutation breeding of P. guiyangense in the future.
　　［Key words］ Pythium guiyangense Su; protoplasts; ultraviolet rays; lithium chloride; mutation breeding
 
　　丝状真菌贵阳腐霉（Pythium guiyangense Su）具有灭蚊能力强，繁殖速度快，易于人工培养以及对其它非靶生物相对安全等优点[1]，在蚊虫生物防治中具有潜在的应用前景。 但是，与大多数微生物一样，贵阳腐霉在人工培养基经过多次传代后其毒力和产孢量会有所下降；同时，与大多数丝状真菌一样，其有效贮藏期不够长。为将贵阳腐霉真正用于灭蚊，提高其灭蚊能力和延长有效贮藏期，对贵阳腐霉进行了改良。微生物改良育种方法较多，原生质体诱变技术是一种行之有效的方法[2，3]。杜海英[4]等通过原生质体诱变选育乳糖酶高产菌株。目前有关利用原生质体紫外诱变和氯化锂诱变提高丝状真菌遗传稳定性方法报道较少。贵阳腐霉是发现的新种，其诱变研究尚未见报道。2008年1月～8月对贵阳腐霉原生质体进行紫外诱变和（或）氯化锂诱变，为该真菌的细胞工程改良奠定基础。
　　1 材料与方法
　　1.1 实验材料
　　1.1.1 菌种来源于贵阳医学院蚊虫生物防治实验室。菌丝在固体培养基上每7天转种1次，培养温度为（25±1）℃。
　　1.1.2 培养基
　　菌丝培养液（KPYG2）：葡萄糖1.5 g/L，酵母1.0 g/L，蛋白胨1.0 g/L，氯化钙0.075 g/L，胆固醇0.02 g/L，玉米油10 g/L。菌丝固体培养基：KPYG2加入琼脂粉10 g/L。酪蛋白水解培养基：NaHPO4·7H2O 1.07g/L，KH2PO4 0.36 g/L，酪蛋白4 g/L，琼脂粉20 g/L。再生培养基：用0.6 mol/L进口蔗糖渗透压稳定剂溶解KPYG2各成分。氯化锂的诱变培养基为LiCl(0.2%～1%)加再生培养基。
　　1.1.3 酶液配制
　　配制浓度为0.6 mol/L的进口蔗糖作为渗透压。取1 g酶用渗透压稳定剂溶解成质量分数为1%的酶液，经0.22 μm微孔滤膜过滤除菌后使用。
　　1.2 诱变方法
　　1.2.1 贵阳腐霉原生质体的制备与再生
　　参考文献[5]制备足够量（6.48×106个/ml）的原生质体，经系列稀释后取0.1 ml于再生培养基平板，同时将原生质体悬液用无菌水稀释，普通培养基平板作为对照。（25±1）℃培养5 d后计算其再生率。
　　1.2.2 原生质体诱变处理
　　1.2.2.1 紫外线（UV）诱变
　　取5 ml (1.0×106个/ml)贵阳腐霉原生质体均匀涂于再生培养基中，在磁力搅拌作用下距20 W紫外灯30 cm处分别照射30 s、60 s、90 s、120 s、150 s、180 s、210 s，对每个处理进行系列稀释；再各取0.1 ml涂布于再生培养基平板，用黑纸包好后置于温室避光培养5 d。以上操作均在红光下进行。根据形成的菌落数计算原生质体致死率和正变率。致死率=（1-再生的菌落数/原生质体总数×再生率）×100%，正突变率=（透明圈比出发菌株大的菌落总数/所有被测菌落总数）×100%。以诱变时间为横坐标，致死率为纵坐标绘制紫外线对原生质体的致死曲线。
　　1.2.2.2 LiCl诱变处理
　　将获得的贵阳腐霉原生质体浓度控制在约106～107个/ml ，加入LiCl 溶液，形成LiCl终浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的1 ml反应体系，置（25±1）℃温箱中避光反应4~5 d，然后置于（25±1）℃恒温摇床分别振荡30、60、90、120、150 min，迅速低温离心（6 000 r/min,4 ℃,5 min），取上清液，加硫代硫酸钠中止反应,用生理盐水洗涤2次、离心、收集上清液[6]，用渗透压稳定剂稀释后涂布平板。对照组的菌液以同样方法进行。计算致死率、正突变率，选择最佳LiCl浓度及诱变时间。
　　1.3 突变株筛选方法
　　1.3.1 菌丝得率
　　切取1 cm3含诱变菌株的琼脂块至菌丝培养液（KPYG2）中，摇床培养5 d，过滤得湿菌丝体，滤干，以100 ml培养基中得菌丝湿重计算得率。
　　1.3.2 突变体粗筛
　　将诱变所得的菌株分别接种于含酪蛋白的培养基上，观察酪蛋白水解圈（HC）。每个平板接种一块出发株作为对照，（25±1）℃培养，测量HC值[7]（HC=水解圈直径/菌落直径）。见图1。
　　1.4 遗传稳定性观察
　　将获得的26株突变株每株接种两个斜面和2个三角瓶传代培养，并对其中生长力特别旺盛的7株进行跟踪观察，筛选出的菌丝得率最高的U22连续8次继代培养，观察其每代菌丝得率的变化。

　　2 结果
　　2.1 紫外线照射的诱变效果原生质体致死率与紫外线照射时间有关。照射时间越长，存活的原生质体越少，即致死率越高（图2）。原生质体经UV处理诱变后形成的再生菌落在菌落直径和形态方面与对照组都有较大差异。以菌落直径大、生长速度快作为标准，共筛选26个诱变株保存。紫外线照射后贵阳腐霉原生质体致死率和正突变率见图3。A.无紫外照射；B.紫外照射60 s；C.紫外照射180 s；D.紫外照射210 s。
　　2.2 LiCl诱变与致死率和正突变率的关系   
　　分别固定处理时间（90min）测最佳LiCl浓度（图4），固定 LiCl浓度（0.6%）测试最佳作用时间（图5）。
　　2.3 贵阳腐霉诱变株的遗传稳定性  
　　7株菌的菌丝得率都很稳定，U2为0.53%，U6为0.68%，U7为0.23%，U14为0.98%，U15为0.32%，U21为1.06%，U22为1.25%，原菌株0.8%，特别是U22菌丝得率最高的。 U22连续8次继代培养，各代的菌丝得率基本上都超过原始菌株（表1）。表1 突变株U22连续8代继代培养菌丝得率比较（略）
　　3 讨论　　
　　丝状真菌菌丝有细胞壁，不宜作诱变材料。去除细胞壁的原生质体对外界环境比较敏感，经诱变剂处理后容易发生突变。原生质体诱变技术一般能保持原有菌种的主要生物学性状特点，育种周期短，突变株生物学性状比较稳定，不易退化。因此，原生质体诱变育种方法已成为当前丝状真菌育种的一种重要方法[8]。在物理和化学诱变研究中，致死率和正突变率的范围选择是关键。一般认为，致死率以90~99.9%效果较好，致死率高说明诱变的作用比较强。但也有报道认为，较低的致死率有利于正突变菌株的产生，以70%~80%或更低的致死率为好[9]。贵阳腐霉原生质体，菌丝体在（25±1）℃培养52~54 h后，用1%纤维素酶与1%溶壁酶、加上1%蜗牛酶消化5 h可获足够量（6.48×106个/ml）的原生质体,但是再生率比较低（0.043%）[5]。 本研究中，经过改良再生培养基后再生率提高为0.54%，此再生率基本上能满足原生质体诱变育种的需要，为开发以贵阳腐霉原生质体为媒介的生物技术提供了一个良好的再生系统。 
　　本试验中发现，紫外照射时间越长，致死率越高；当照射时间大于210 s时，致死率高于91.5%（图3），表明贵阳腐霉原生质体对紫外线的敏感性较低。经反复试验的结果，贵阳腐霉原生质体在20 W紫外灯30 cm处照射180s诱变效果最好，该条件下致死率为81.3%时，正突变率为78.5%。 
　　HC值是反映菌株产酶能力的指标。一般来说，高HC值的突变株优于低HC值的突变株。虽然LiCl导致的总体正突变率（图4和图5）低于与紫外线诱导引起的总体正突变率（图3），但LiCl正突变株HC值总体较紫外诱变株HC高，仍然说明LiCl具有较好的诱变效果。

　　在0.6%LiCl作用90 min条件下进行两次试验，致死率分别为86.9%、87.1%，正突变率分别为26.9%、27.6%，为最高正突变率，方便筛选。因此,0.6%LiCl作用90 min作为LiCl的最佳诱变条件。　　
　　鉴于突变菌株的性状常常不稳定，尤其是在继代培养时尤为明显。为了获得稳定的突变株，检测所得菌株性状的遗传稳定性是物理和化学诱变育种工作中的重要环节。目前，可行的遗传稳定性检测方法主要是比较菌丝得率，这种方法并不理想，因为除遗传作用以外还有其他影响菌丝得率的因素。有报道用酶活性[10]和分子鉴定方法[11]检测菌丝得率，这将是研究贵阳腐霉原生质体的下一步工作。