酵母双杂交简介
2011-09-27 10:12:48   来源：   评论：0 点击：

　　对真核生物调控转录起始过程的认识是酵母双杂交系统建立的基础。人们研究发现细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。大多转录激活因子是由两个或两个以上相互独立的结构域构成, DNA结合结构域(DNA binding domain, 简称为DB)和转录激活结构域(activation domain, 简称为AD)。随后人们发现二个结构域不但分开后仍具有各自的功能，而且不同来源的两结构域可重建并发挥转录激活作用。Fields和Song等正是基于这一原理建立了酵母双杂交系统。

　　他们以调控SUC2基因相关的两个蛋白质Snf1和Snf2为模型, 将前者与Gal4的DB结构域融合, 另外一个与Gal4的AD结构域的酸性区域融合。如果在Snf1和Snf2之间存在相互作用, 那么分别位于这两个融合蛋白上的DB和AD就能重新形成有活性的转录激活因子, 从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示目的蛋白相互作用的基因即为报道基因(reporter gene)。通过对报道基因表达产物的检测, 反过来可判别两个目的蛋白质之间是否存在相互作用。 在此Fields等人采用编码β-半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因, 并且在该基因的上游调控区引入受Gal4蛋白调控的GAL1序列。 这个改造过的LacZ基因被整合到酵母染色体URA3位上。 而酵母的GAL4基因和GAL80基因(Gal80是Gal4的负调控因子)被缺失, 从而排除了细胞内源调控因子的影响。 已经知道在Snf1和Snf2之间存在相互作用。 结果发现只有同时转化了Snf1和Snf2融合表达载体的酵母细胞才有β-半乳糖苷酶活性, 单独转化其中任何一个载体都不能检测出β-半乳糖苷酶活性。

　　酵母双杂交系统主要有二类载体，一类是含有DNA -binding domain的载体，另一类是含DNA-activating domain的载体。上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。

　　目前发展起来的各种双杂交系统大多是以Fields等人建立的系统为基础的。这些新系统主要对报道基因及两个表达载体做了一些改进。其中一个重要改进是引入额外的报道基因, 如广泛采用的HIS3基因。经过改造带有HIS3报道基因的酵母细胞, 只有当HIS3被启动表达才能在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长。大多数双杂交系统往往同时使用两个甚至三个报道基因, 其中之一是LacZ。 这些改造后的基因在启动子区有相同的转录激活因子结合位点, 因此可以被相同的转录激活因子(如上述的Gal4蛋白)激活。 通过这种双重或多重选择既提高了检测灵敏度又减少了假阳性现象。