诱变育种
2007-12-27 23:32:15   来源：本站原创   评论：0 点击：

用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株，供生产或科研用。
(1)    诱变育种工作的原则
  1) 选择简便有效的诱变剂。
  2) 挑选优良的出发菌株(即用于育种的原始菌株)。
3) 处理单细胞或单孢子悬液，使呈分散状态，均匀接触诱变剂。细菌或酶母菌悬液中加玻璃珠并振荡，或用脱脂棉过滤，可获均匀分散的单细胞悬液。放线菌和霉菌的菌丝是多核的，诱变育种应用其单核的孢子。用稀释的表面活性剂制备单孢子悬液，常用的表面活性剂是吐温-80(Tween-80)，浓度0．01％-0．1％。  
4) 选用最适剂量 在高诱变率的前提下，既能扩大变异幅度，又能促使变异移向正变范围的剂量，即为最适剂量。
  5) 利用复合处理的协同效应 两种或多种诱变剂的先后使用，同一种诱变剂的重复使用，两种或多种诱变剂的同时使用，均常呈现一定的协同效应，会取得更好的诱变效果。
  6) 利用微生物形态、生理与产量间的相关指标，如变色圈、水解圈、抑菌圈、反应圈的大小等，以便在初筛中即可从形态性状估计其生产潜力。  
7) 设计和采用高效筛选方案和方法，以期花费最少的工作量，在最短的时间内，取得最大的成效。
(2)    诱变育种的一般步骤  
出发菌株叶纯化——→斜面培养——→单细胞或单孢子悬液——→诱变剂处理——→平板分离——→斜面培养——→初筛——→斜面培养——→复筛——→斜面培养——→中试——→生产实践。
(3)    营养缺陷型突变株的筛选
  1) 与营养缺陷突变有关的三类遗传型个体
  ① 营养缺陷型(auxotroph)——原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，丧失了合成某种代谢产物的能力，必须在培养基中外源补加该物质才能生长，这类突变菌株，谓营养缺陷型突变株，简称营养缺陷型。它们根据所短缺的、不能合成的物质来命名。书写时取前三个英文字母，右上角写上负号“-”，代表缺陷型或突变型。如组氨酸(histidine)营养缺陷型，写作his-。  
  ② 野生型(wildtype)——变异前的原始菌株。在英文字母右上角写上正号“+”表示之，如his+。
  ③ 原养型(prototroph)——营养缺陷型菌株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型相同，表示方法亦同野生型。  
2) 与筛选营养缺陷型有关的三类培养基
  ① 基本培养基(M.M.,minimalmedium)——能满足某一菌种的野生型或原养型菌株营养要求的最低成分的合成培养基。
  ② 补充培养基(S.M., supplementalmedium)——在基本培养基中有针对性地补加某一种或几种营养成分，以满足相应的营养缺陷型菌株生长需要(其他营养缺陷型仍不能生长)的培养基。
  ③ 完全培养基(C.M., completemedium)——可满足该菌各种营养缺陷型菌株营养需要的天然或半合成培养基。
  3) 筛选营养缺陷型菌株的一般步骤和方法
  ① 诱变 常用紫外线诱变形成大量营养缺陷型菌株。用15W或20W紫外灯管，距离15cm—30cm，照射lOsec—20min。在照射受试菌前，灯管须预热20min，使灯光稳定。菌悬液要磁力搅拌，使所有单细胞或单孢子均匀受到照射。特别要注意，应在黑暗或红外光下操作，接种后器皿用黑布包严，防止发生可见光的修复作用。
  ② 淘汰野生型
a) 抗生素法 某些抗生素能杀死生长繁殖着的微生物，而对处于休止状态的微生物无杀伤作用。如青霉素能抑制细菌细胞壁肽聚糖的生物合成，制霉菌素可损伤真菌细胞膜，二者可分别杀死生长繁殖着的细菌、真菌。具体方法见下面4)。
  b) 菌丝过滤法 适用于放线菌、霉菌等丝状微生物。在基本培养基中野生型孢子能萌发长成菌丝体，而营养缺陷型孢子则不生长。将经诱变处理的孢子接种于液态基本培养基中，振荡培养lOh—12h，使原养型萌发(以肉眼刚能看见菌丝为度)，然后以滤纸、棉花或玻璃过滤漏斗过滤，菌丝被滤除，未萌发的缺陷型孢子能顺利通过，从而达到富集营养缺陷型的目的。
  ③ 检出缺陷型的常用方法
  a) 逐个测定法(点种法) 把经诱变处理并淘汰野生型后的菌液在完全培养基上涂布
分离，将培养后长出的每一个菌落分别点种在基本培养基和另一个完全培养基上，凡在基本培养基上不能生长而在完全培养基的相应位置上能生长的菌落，表明其为营养缺陷型。
  b) 夹层培养法 经诱变处理后的菌液，稀释后与基本培养基混匀并倾入平皿中，待凝固后，再加上一薄层不含菌的基本培养基。培养后在皿底将长出的菌落做上标记。然后加上一层完全培养基，再经培养后，新出现的菌落多数是营养缺陷型(图3—31)。此法适用于兼性厌氧的细菌。
  c) 影印法 将丝绒包在直径小于平皿的圆柱台上，固定，作为影印接种工具，灭菌备用。将经诱变处理并淘汰野生型的菌液涂布于完全培养基表面上，培养，待长出菌落后，用影印接种工具在此平板上轻按一下，然后在另一基本培养基平板上按一下。经培养后在基本培养基上不长而在完全培养基的相应部位上生长的菌落，为营养缺陷型(图3—32)。
④ 鉴定营养缺陷型——生长谱法 将检出的缺陷型菌株接种在完全培养基上培养，把生长的菌体或孢子洗下，离心清洗后制成浓度为107个／mi-108个／mi的菌悬液。取0．1ml该悬液与基本培养基混匀倒皿，冷凝并稍干燥后，分区加沾有各种营养物的圆滤纸片，培养，观察生长反应(图3—33)。    
在筛选营养缺陷型的过程中必须注意表型延迟现象。．由于诱变剂一般仅作用于DNA的某一单链，故突变无法反映在当代的表型上，需经DNA复制和细胞分裂后，才使表型发生变异，此即表型延迟现象。
  4) 富集和分离抗生素敏感菌的营养缺陷型突变株的抗生素法 将抗生素加入原养型培
养基(即培养基中缺少营养缺陷型所需的养分)中，能杀死生长中的野生型细胞；而不能生长的突变株得以幸免，筛选过程见图3—34。
  5) 营养缺陷型在科研和生产实践中的应用 在科学研究中，营养缺陷型既可作为研究代谢途径和杂交、转化、转导、原生质体融合等遗传规律所必不可少的标记菌种，也可作为氨基酸、维生素或碱基等生物测定的试验菌种。在生产实践中，营养缺陷型可作为菌种杂交、重组育种和构建工程菌时所不可缺少的带有特定基因标记的亲本菌株，它们还常被用作生产核苷酸、氨基酸等代谢产物的生产菌株。由于营养缺陷型在代谢途径中某一步骤发生缺陷，致使终产物不能积累，从而遗传性地解除反馈抑制，使中间代谢产物或另一分支途径的末端产物得以积累；
例如，用鬲丝氨酸营养缺陷型作为赖氨酸的生产菌株，由于该突变株的遗传性，解除了赖氨酸与苏氨酸的协同反馈抑制，因此，在培养系统中限量补充苏氨酸，就可使天冬氨酸半醛全部向赖氨酸方向转化，赖氨酸产量大大提高。