染菌的检查和判断
2010-09-24 21:36:40   来源：青岛海博《微生物工程》   评论：0 点击：

一、种子培养和发酵的异常现象
发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中的某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。对此，应及时查明原因，加以解决。
 
1．种子培养异常
种子培养异常表现在培养的种子质量不合格。种子质量差会给发酵带来较大的影响。然而种子内在质量常被忽视，由于种子培养的周期短，可供分析的数据较少，因此种子异常的原因一般较难确定，也使得由种子质量引起的发酵异常原因不易查清。种子培养异常的表现主要有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。
 
(1)菌体生长缓慢  种子培养过程中菌体数量增长缓慢的原因很多。培养基原料质量下降、菌体老化、灭菌操作失误、供氧不足、培养温度偏高或偏低、酸碱度调节不当等都会引起菌体生长缓慢。此外，接种物冷藏时间长或接种量过低而导致菌体量少，或接种物本身质量差等也都会使菌体数量增长缓慢。
 
(2)菌丝结团  在培养过程中有些丝状菌容易产生菌丝团，菌体仅在表面生长，菌丝向四周伸展，而菌丝团的中央结实，使内部菌丝的营养吸收和呼吸受到很大影响，从而不能正常地生长。菌丝结团的原因很多，诸如通气不良或停止搅拌导致溶解氧浓度不足；原料质量差或灭菌效果差导致培养基质量下降；接种的孢子或菌丝保藏时间长而菌落数少，泡沫多；罐内装料小、菌丝粘壁等会导致培养液的菌丝浓度比较低；此外接种物种龄短等也会导致菌体生长缓慢，造成菌丝结团。
 
(3)代谢不正常  代谢不正常表现出糖、氨基氮等变化不正常，菌体浓度和代谢产物不正常。造成代谢不正常的原因很复杂，除与接种物质量和培养基质量差有关外，还与培养环境条件差、接种量小、杂菌污染等有关。
 
2．发酵异常
不同种类的发酵过程所发生的发酵异常现象，形式虽然不尽相同，但均表现出菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。
 
 (1)菌体生长差  由于种子质量差或种子低温放置时间长导致菌体数量较少、停滞期延、发酵液内菌体数量增长缓慢、外形不整齐。种子质量不好、菌种的发酵性能差、环境条件差、培养基质量不好、接种量太少等均会引起糖、氮的消耗少或间歇停滞，出现糖、氮代谢缓慢现象。
 
(2)pH值过高或过低  发酵过程中由于培养基原料质量差、灭菌效果差、加糖、加油过多或过于集中，将会引起pH值的异常变化。而pH值变化是所有代谢反应的综合反映，在发酵的各个时期都有一定规律，pH值的异常变化就意味着发酵的异常。
 
(3)溶解氧水平异常  根据发酵过程出现的异常现象如溶解氧、pH值、排气中的CO2含量以及微生物菌体酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。对于特定的发酵过程要求一定的溶解氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶解氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶解氧水平发生了异常的变化，一般就是发酵染菌发生的表现。
 
在正常的发酵过程中，发酵初期菌体处于适应期，耗氧量很少，溶解氧基本不变；当菌体进入对数生长期，耗氧量增加，溶解氧浓度很快下降，并且维持在一定的水平，在这阶段中操作条件的变化会使溶解氧有所波动，但变化不大；而到了发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶解氧又再度上升；当感染噬菌体后，生产菌的呼吸作用受抑制，溶解氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶解氧的变化比菌体浓度更灵敏，能更好地预见染菌的发生。
 
由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶解氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好氧性微生物时，溶解氧的变化是在较短时间内下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶解氧升高。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中C02含量的变化是规律的。染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中C02含量的异常变化，如杂菌污染时，糖耗加快，C02含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢，C02含量减少。因此，可根据C02含量的异常变化来判断是否染菌。
 
(4)泡沫过多  一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定的规律的。但是，由于菌体生长、代谢速度慢、接种物嫩或种子未及时移种而过老、蛋白质类胶体物质多等都会使发酵液在不断通气、搅拌下产生大量的泡沫。除此之外，培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖受到破坏后产生的氨基糖会抑制菌体的生长，也会使泡沫大量产生，从而使发酵过程的泡沫发生异常。
 
(5)菌体浓度过高或过低  在发酵生产过程中菌体或菌丝浓度的变化是按其固有的规律进行的。但是如罐温长时间偏高，或停止搅拌时间较长造成溶氧不足，或培养基灭菌不当导(营养条件较差，种子质量差菌体或菌丝自溶等均会严重影响到培养物的生长，导致发酵液，菌体浓度偏离原有规律，出现异常现象。
 
二、染菌的检查和判断
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检查法、肉汤培养法、平板培养法、发酵过程的异常观察法等。 
 
（一）染菌的检查方法
1、显微镜检查法(镜检法)
用革兰染色法(Gramsstain)对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。如发现有与生产菌形态特征不一样的其他微生物的存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最为简单、最直接，也是最常用的检查方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。
 
2、肉汤培养法
通常用组成为0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％氯化钠、0.8％蛋白胨、0.4％的酚红溶液(pH=7．2)的葡萄糖酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接人经完全灭菌后的肉汤培养基中，分别于37℃、27℃进行培养，随时观察微生物的生长情况，并取样进行镜检，判断是否有杂菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，同时此法也可用于噬菌体的检查。
 
3、平板划线培养或斜面培养检查法
将待检样品在无菌平板上划线，分别于37℃、27℃进行培养，一般24h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37℃条件下培养6h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。
 
（二）染菌的判断
无菌试验时，如果肉汤连续三次发生变色反应(由红色变为黄色)或产生混浊，或平板培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。有时肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。一般来讲，无菌试验的肉汤或培养平板应保存并观察至本批(罐)放罐后12h，确认为无杂菌后才能弃去。无菌试验期间应每6h观察一次无菌试验样品，以便能及早发现染菌。
 
（三）各种检查方法的比较
显微镜检查方法简便、快速，能及时发现杂菌，但由于镜检取样少，视野的观察面也小，因此不易检出早期杂菌。平板划线法和肉汤培养方法的缺点是需经较长时间培养(一般要过夜)才能判断结果，且操作较繁琐，但它要比显微镜能检出更少的杂菌，而且结果也更为准确。
 
（四）杂菌检查中的问题
检查结果应以平板划线和肉汤培养结果为主要根据；平板划线和肉汤培养应做三个平行样；要定期取样；酚红肉汤和平板划线培养样品应保存至放罐后12小时，确定为无菌时方可弃去；取样时要防止外界杂菌混入。
 
（五）检查的工序和时间
选择哪些生产工序和时间的样品检查也是十分重要的问题。科学合理的选择检查工序和时间，对于除去已污染杂菌的物料，避免下道工序再遭染菌，有着直接的指导意义。有时即使由于检查时间较长，未能及时据导本批生产，但对于找出造成染菌事故的环节，分析染菌原因，杜绝染菌漏洞也是不可缺少的。
 
由于生产菌种相产品的不同，检查的时间也不完全一样：但总的原则是一致的，即每个工序或经一定时间都应进行取样检查。