一株植物病原真菌拮抗细菌的分离与鉴定
2009-12-16 22:16:49   来源：本站原创   评论：0 点击：

薛东红?1，刘训理?1*，陈　凯?1，吴　凡?1，王智文?1，何　亮?2

（1.山东农业大学林学院，山东 泰安　271018；2.西北农林科技大学，陕西 杨陵　712100）

摘要：从泰山土壤中分离获得一株对多种植物病原真菌具有拮抗作用的细菌。经过形态观察、生理生化特征分析及16S rDNA碱基序列测定和同源性分析，鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，该菌株的16S rDNA序列已在GenBank中注册，登录号为AY756511。

关键词：拮抗细菌；蜡状芽孢杆菌；鉴定

中图分类号：Q939.9　　　文献标识码：A　　　文章编号：1000-2324(2006)01-0001-05

收稿日期：2005-08-18

基金项目：国家自然科学基金项目(30571245)资助.

作者简介：薛东红（1981-　），女，在读硕士研究生.从事微生物活性物质研究.

通讯作者：Author for correspondence.E-mail:xuiu@sdau.edu.cn

ISOLATION AND IDENTIFICATION OF A STRAIN OF ANTAGONISTIC BACTERIA?INHIBITING AGAINST PLANT PATHOGENIC FUNGI

XUE Dong-hong,LIU Xun-li,CHEN Kai,WU Fan,WANG Zhi-wen,HE Liang

(1.College of Forestry,Shandong Agricultural,Taian 271018,China;2.Northwest Sci-Tech University of Agricultural and Forestry,Yangling 712100,China ）

Abstract:C332，a strain of antagonistic bacteria,isolated from Mountain Tai soil,had strong inhibition effect against several plant pathogenic fungi.It was identified as ?Bacillus cereus ?based on the results of morphologic characteristics,physiological and biochemical properties and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence.The sequence of 16S rDNA obtained in this study has been registered at GenBank database and the accession number was AY756511.

Key Words:Tntagonistic bacteria,?Bacillus cereus?,Tdentification

　　植物病害是农业生产的大敌，据联合国粮农组织(FAO)统计，每年因植物病害造成的平均损失为总产量的10％～15%［1］。目前，化学杀菌剂虽然仍是防治植物病害的主体，但是由于其潜在的对人类健康的危害、环境的污染、非靶标生物的影响及植物病原菌抗性的产生等问题，它的发展受到各方面的限制。寻找广谱、高效、低毒的生物农药，尽量减少化学药物的用量，符合生态农业和可持续发展农业的需要。据统计，国际上约90％生物农药产品是微生物杀虫剂，有专家预测，第二个商业化生物农药将是微生物杀菌剂［2］。

　　拮抗细菌C332是本实验室从泰山土壤中分离获得，对多种植物病原真菌有较强的抑制作用。初步研究发现，该菌株发酵性状优异，抗菌物质耐高温、性质稳定，在植病生防上具有潜在应用价值。本研究通过形态观察、生理生化特征和16S rDNA序列分析，对该菌株进行鉴定。

1　材料和方法

1．1　供试菌株及试剂

　　C332菌株由本实验室从泰山土壤中分离获得，大肠杆菌(Escherichia coli?DH 5α)、茶轮斑病菌(Phyllosticta thesefolia)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)、烟草赤星病菌(Alternaria alternata)、茶云纹叶枯病菌(Colletotrichum camellia)由本实验室保存。

　　克隆质粒pUCm-T、DNA聚合酶、T₄DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒购自上海生工生物工程技术服务有限公司，其它试剂均为进口或国产分析纯。

1．2　形态特征观察

　　将C332菌株接种在LB固体培养基上，28℃培养18～24h，观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形状和革兰氏染色，用电镜观察菌体大小、荚膜和鞭毛着生情况。

1．3　生理生化指标测定

　　各项生理生化指标的测定均参照文献［3-4］。

1．4　16S rDNA片断扩增和序列分析

1．4．1　基因组DNA提取　细菌基因组DNA的提取及16S rDNA片断扩增均参照参考文献［5-7］。

　　C332菌株用LB液体培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 5g，水1000mL)培养至OD₆₀₀=0．8，离心收集菌体，采用CTAB法提取基因组DNA。

1．4．2　16S rDNA片断扩增　采用扩增细菌16S rDNA的一对保守引物，正向引物16Sf：AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG；反向引物16Sr：ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT，这对引物可扩增约1．6kb的16S rDNA全序列。PCR反应体系(30μL)为：10×Buffer(Mg²⁺)2．5μL、10mMdNTP2μL、10μM引物各lμL、Taq酶0．15μL、模板1μL、ddH₂O22．35μL。PCR反应条件为95℃ 4min；94℃lmin，56℃1min，72℃ 2min，循环30次；72℃ 20min。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为1×TAE，选取Lambda DNA／EcoRI+HindⅢ Marker,3作为Marker。

1．4．3　克隆与筛选　PCR产物经-UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒纯化后，连接克隆载体pUCm-T，转化到Escherichia coli DH 5α，在加有Amp／IPTG／X-Gal的LB平板上进行蓝白斑筛选。挑取白色菌落，进行PCR鉴定，分析插入片段的大小，挑出重组克隆。

1．4．4　DNA序列测定及分析　重组克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，测序结果用GenBank中的 BLAST软件进行同源性比较，采用DNAMAN Version 5．1软件中的Multiple Sequence Alignment程序进行多序列同源性分析，并构建系统发育树(Bootstrap=1000)。

1．5　C332菌株对几种植物病原真菌的拮抗作用

　　在PDA平板中心接种植物病原菌菌盘(直径5mm)，两侧2cm处接种C332菌株，置25℃培养箱中培养，观察抑菌情况。

2　结果与分析

2．1　形态特征及染色结果

　　C332菌株的菌体大小为(0．9～1．2)μm×(2．0～4．0)μm，革兰氏染色阳性，兼性厌氧，长杆状，产芽孢，有荚膜，稀疏周生鞭毛。平板培养24h后，形成的单菌落乳白色，粘稠厚重，半透明，湿润光亮，表面粗糙，似毛玻璃或蜡状。C332菌株的电镜照片见图1。

图1　C332菌株的电镜照片

Fig.1 Electron micrograph of strain C332

2．2　生理生化特征

　　C332菌株硝酸盐还原、V-P反应、接触酶、明胶水解、淀粉水解、酪素水解、酪氨酸

表1　拮抗细菌C332的生理生化特征

Table l　Characteristic of antagonistic C332 strain

　　注： “+”阳性；“-”阴性。

　　Note：“+"positive；“-”negative．

　　水解均为阳性；可利用葡萄糖、木糖；不能利用甘露醇。C332菌株的主要生理生化特征见表1。

2．3　C332菌株16S rDNA片断序列分析

　　经过1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示的图像如图2所示，由图可看出，利用16Sf／16Sr—

图2　1%Agarose gel电泳结果

Fig.2 Electrophoresis result with 1% agarose gel

　　对引物扩增出的序列位于1584bp附近，符合常规的16S rDNA序列长度。测定结果表明，扩增的DNA序列全长1516bp，这个序列在GenBank上的注册号为AY756511。其序列如下：

1　　 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GATGAACGCT GGCGGCGTGC CTAATACATG CAAGTCGAGC

61　  GAATGGATTA AGAGCTTGCT CTTATGAAGT TAGCGGCGGA CGGGTGAGTA ACACGTGGGC

121　 AACCTGCCCA TAAGACTGGG ATAACTCCGG GAAACCGGGG CTAATACCGG ATAACATTTT

181　 GAACCGCATG GTTCGAAATT GAAAGGCGGC TTCGGCTGTC ACTTATGGAT GGACCCGCGT

241　 CGCATTAGCT AGTTGGTGAG GTAACGGCTC ACCAAGGCAA CGATGCGTAG CCGACCTGAG

301　 AGGGTGATCG GCCACACTGG GACTGAGACA CGGCCCAGAC TCCTACGGGA GGCAGCAGTA

361　 GGGAATCTTC CGCAATGGAC GAAAGTCTGA CGGAGCAACG CCGCGTGAGT GATGAAGGCT

421　 TTCGGGTCGT AAAACTCTGT TGTTAGGGAA GAACAAGTGC TAGTTGAATA AGCTGGCACC

481　 TTGACGGTAC CTAACCAGAA AGCCACGGCT AACTACGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACGT

541　 AGGTGGCAAG CGTTATCCGG AATTATTGGG CGTAAAGCGC GCGCAGGTGG TTTCTTAAGT

601　 CTGATGTGAA AGCCCACGGC TCAACCGTGG AGGGTCATTG GAAACTGGGA GACTTGAGTG

661　 CAGAAGAGGA AAGTGGAATT CCATGTGTAG CGGTGAAATG CGTAGAGATA TGGAGGAACA

721　 CCAGTGGCGA AGGCGACTTT CTGGTCTGTA ACTGACACTG AGGCGCGAAA GCGTGGGGAG

781　 CAAACAGGAT TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGAGTGCTA AGTGTTAGAG

841　 GGTTTCCGCC CTTTAGTGCT GAAGTTAACG CATTAAGCAC TCCGCCTGGG GAGTACGGCC

901　 GCAAGGCTGA AACTCAAAGG AATTGACGGG GGCCCGCACA AGCGGTGGAG CATGTGGTTT

961　 AATTCGAAGC AACGCGAAGA ACCTTACCAG GTCTTGACAT CCTCTGAAAA CCCTAGAGAT

1021　AGGGCTTCTC CTTCGGGAGC AGAGTGACAG GTGGTGCATG GTCGTCGTCA GCTCGTGTCG

1081　TGAGATGTTG GGTTAAGTCC CGCAACGAGC GCAACCCTTG ATCTTAGTTG CCATCATTAA

1141　GTTGGGCACT CTAAGGTGAC TGCCGGTGAC AAACCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAA

1201　TCATCATGCC CCTTATGACC TGGGCTACAC ACGTGCTACA ATGGACGGTA CAAAGAGCTG

1261　CAAGACCGCG AGGTGGAGCT AATCTCATAA AACCGTTCTC AGTTCGGATT GTAGGCTGCA

1321　ACTCGCCTAC ATGAAGCTGG AATCGCTAGT AATCGCGGAT CAGCATGCCG CGGTGAATAC

1381　GTTCCCGGGC CTTGTACACA CCGCCCGTCA CACCACGAGA GTTTGTAACA CCCGAAGTCG

1441　GTGGGGTAAC CTTTTTGGAG CCAGCCGCCT AAGGTGGGAC AGATGATTGG GGTGAAGTCG

1501　TAACAAGGTA GCCGTA

　　上述碱基序列在NCBI数据库中BLAST，利用DNAMAN软件构建系统进化树(图3)，括号内为各菌株的GenBank登录号。由图看出，C332菌株的遗传进化距离与芽孢杆菌属最近，它与蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)同处于一个最小的分支，与已知菌株Bacillus cereus strain LRN的同源性达到98％。

图3　系统发育树状图

Fig.3 phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of Bacillus

　　综合C332菌株的形态特征、生理生化指标测定结果和16S rDNA序列分析，鉴定C332菌株为蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)。

2.4　C332菌株对几种植物病原菌的抑菌作用

　　C332菌株对茶轮斑病菌、黄瓜枯萎病菌、立枯丝核菌、烟草赤星病菌、茶云纹叶枯病菌等有较强的抑制作用，其中，对前三者的抑菌效果如图4所示。由图看出，C332菌株在培养基上均可产生明显的抑菌带，带宽分别为3．5mm、5．0mm、3．0mm，这说明C332菌株的某些分泌物可抑制植物病原真菌的生长。

图4　C332菌株对三种植物病原菌的作用

Fig.4 effect of strain C332 on Plant Pathogenic Fungi

A对茶轮斑病菌的作用　Effect on Phyllosticta thesefolia??
B对黄瓜枯萎病菌的作用　Effect on fusarium oxysporum??
C对立枯丝核菌的作用　Effect on fhizoctonia solani

3　讨论

　　基于16S rDNA序列分析的系统发育学和表型特征存在较好的相关性，系统发育学分析在细菌鉴定中越来越得到广泛的应用。在构建系统发育树中，C332菌株与Bacillus cereus?和Bacillus thuringiensis同源性都比较高且相近，结合菌株的表型特征和理化性质，C332菌株应属于蜡状芽孢杆菌。但C332菌株与蜡状芽孢杆菌种内的一些菌株存在一定的差异，如木糖产酸和葡萄糖产气等，这可能是由该菌株的生态差异造成的。

　　微生物之间的拮抗现象早已被认识和广泛应用，从自然界寻找和筛选新的抗菌物质是微生物研究的重要内容。芽孢杆菌是一类重要的抗生素产生菌，Mycocerin［8］和刘建国［9］等人的研究表明，蜡状芽孢杆菌(B.cereus)可产生多肽类抗菌素［10］，其结构多呈闭合环状，少数为线形，仅少数抗真菌。C332菌株抗菌谱广，抑菌性能优异。目前，作者等正在进行抗菌物质的分离、纯化及结构鉴别等工作，以期为该菌株及其抗菌物质的应用提供理论参考。

参考文献

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〔9〕刘建国，丛威，欧阳藩等．新型抗真菌多肽APS的抑菌性能研究〔J〕．中国生物防治，1999,15(3)：108-110

〔10〕王岳，方金瑞．抗生素〔M〕.北京：科学出版社，1988．