微生物鉴定的技术与方法—遗传学分类法
2009-12-16 22:07:15   来源：本站原创   评论：0 点击：

  分子遗传学分类法是以微生物的遗传型（基因型）特征为依据，判断微生物间的亲缘关系，排列出一个个的分类群。目前较常使用的方法有：
1、DNA中（G+C）mol%分析
   每一个微生物种的DNA中（G+C）mol%的数值是恒定的，不会随着环境条件、培养条件等的变化而变化，而且在同一个属不同种之间，DNA中（G+C）mol%的数值不会差异太大，可以某个数值为中心成簇分布，显示同属微生物种的（G+C）mol%范围。DNA中（G+C）mol%分析主要用于区分细菌的属和种，因为细菌DNA中（G+C）mol%含量的变化范围一般在25%—75%；而放线菌DNA中（G+C）mol%比例范围非常窄（ 37%—51%）。一般认为任何两种微生物在（G+C）含量上的差别超过了10%，这两种微生物就肯定不是同一个种。因此可利用（G+C）mol%来鉴别各种微生物种属间的亲缘关系及其远近程度。值得注意的是，亲缘关系相近的菌，其（G+C）mol%含量相同或者近似，但（G+C）mol%相同或近似的细菌，其亲缘关系并不一定相近，这是因为这一数据还不能反映出碱基对的排列序列，而且如放线菌的的（G+C）mol%在37%51%之间，企图在这么小的范围内区分放线菌的几十个属显然是不现实的。要比较两种细菌的DNA碱基对排列序列是否相同，以及相同的程度如何，就需做核酸杂交试验。

2、DNA-DNA杂交
   DNA杂交法的基本原理是用DNA解链的可逆性和碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外加热解链，并在合适的条件下，使互补的碱基重新配对结合成双链DNA，然后根据能生成双链的情况，检测杂合百分数。如果两条单链DNA的碱基顺序全部相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率为100%。如果两条单链DNA的碱基序列只有部分相同，则它们能生成的“双链 ”仅含有局部单链，其杂合率小于70%。由此，杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，它们之间的亲缘关系也就越近。如两株大肠埃希氏菌的 DNA杂合率可高达100%，而大肠埃希氏菌与沙门氏菌的DNA杂合率较低，约为70%。（G+C）mol%的测定和DNA杂交实验为细菌种和属的分类研究开辟了新的途径，解决了以表观特征为依据所无法解决的一些疑难问题，但对于许多属以上分类单元间的亲缘关系及细菌的进化问题仍不能解决。

3、DNA-rRNA杂交
   目前研究RNA碱基序列的方法有两种。一是DNA与rRNA杂交，二是16SrRNA寡核苷酸的序列分析。DNA与rRNA杂交的基本原理、实验方法同rRNA杂交一样，不同的是：①杂交中同位素标记的部分是DNA，而DNA与rRNA杂交中同位素标记的部分是rRNA；②杂交结果用同源性百分数表示，而DNA与rRNA杂交结果用Tm（e）和RNA结合数表示。Tm（e）值是DNA与rRNA杂交物解链一半时所需要的温度。RNA结合数是100ugDNA所结合的rRNA的ug数。根据这个参数可以作出RNA相似性图。在rRNA相似性图上，关系较近的菌就集中到一起 。关系较远的菌在图上占据不同的位置。用rRNA同性试验和16StRNA寡核苷酸编目的相似性比较rRNA顺反子的实验数据可得到属以上细菌分类单元的较一致的系统发育概念，并导致了古细菌的建立。
4、16SrRNA（16SrDNA）寡核苷酸的序列分析
   首先，16SrRNA普遍存在于原核生物（真核生物中其同源分子是18SrRNA）中。rRNA参与生物蛋白质的合成过程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物进化的漫长历程中保持不变，可看作为生物演变的时间钟。其次，在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的各类生物亲缘关系的研究。第三，16SrRNA的相对分子质量大小适中，约154个核苷酸，便于序列分析。因此，它可以作为测量各类生物进化和亲缘关系的良好工具。
    分离菌株16SrRNA基因的分离较为简单。从平板中直接挑取一环分离菌株细胞，加入100ul无菌重蒸H2O中，旋涡混匀后，沸水浴2min，1200r/min离心5min，上清液中即含16SrRNA基因，可直接用于PCR扩增。分离菌株16SrRNA基因的PCR扩增和序列测定的一般步骤为：16SrRNA基因的PCR引物：5-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3,5-AAGGA GGTGA TCCAG CCGCA-3 。扩增反应体积50ul，反应条件为：95°预变性5min，94°变性1min，55°退火1min，72°延伸2min，共进行29个循环，PCR反应在PTC-200型热循环仪上进行。取5ul反应液在10g/l的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。PCR产物测序可由专门技术公司完成。测序得到分离菌株16SrDNA部分序列，此序列一般以*.f.seq形式保存，可以用写字板或 软件打开，将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析。
   遗传距离矩阵与系统发育树构建，可采用DNAstart软件包中的MegAlign程序计算样本间的遗传距离。由GenBank中得到相关菌株的序列，与本研究分离菌株所测得序列一起输入Glustalxl.8程序进行DNA同源序列排列，并经人工仔细核查。在此基础上，序列输入pHYLIP3.6软件包，以简约法构建系统发育树。使用Kimura2-parameter法，系统树各分枝的置信度经重抽样法500次重复检测，DNA序列变异中的转换和颠换赋予相同的加权值。具体方法可不断加以改进，以提高利用分子生物学技术编定的准确性和效率。