工业菌种改良述评（三）
2007-10-04 11:35:47   来源：工业微生物   评论：0 点击：

　　原生质体融合衍生的技术方法,①原生质体诱变方法,用以改善传统诱变育种的效果;②利用原生质体再生时对再生条件的控制,使菌株遗传特性发生改变的原生质体再生育种方法;③通过加热或UV照射处理,使参与原生质体融合的一方灭活的“定向”融合技术,灭活一方在融合过程中可将其遗传物质传递给有活力的受体原生质体。另一个好处是供体方可能会产生对受体原生质体有致死作用的酶或抗生素,热灭活可破坏这些不利因素;④利用原生质体进行染色体DNA转化,质粒DNA高频转化、原生质体的转染、利用脂质体进行原生质体的转化和转染技术;⑤原生质体融合技术和电子技术相结合的电融合技术:电诱导原生质体融合技术是将两个彼此靠近的细胞在电脉冲的作用下,两者发生质膜的融合,这种方法需专门的仪器-电融合仪方法直观、定向、高效;⑥电穿孔法(electropora-tion),电压脉冲使电场中的细胞膜可逆地形成小孔(nm),周围溶液中的外源基因得以进入细胞,这是一种将外源性分子(基因或外源DNA序列),引入细胞内的方法,用以进行转染或细胞融合。
　　所有这些新技术方法无疑均提高了原生质体融合的效率,扩大了原生质体融合的应用范围,特别是为基因工程中外源基因的转移提供了一种十分有效的手段。
2.3　基因工程是工业菌种改良最具魅力、最有潜力的技术
　　(1)基因工程
　　基因工程也称遗传工程、重组DNA技术是现代生物技术的核心,以细胞外进行DNA拼接、重组技术为基础的基因工程,是以人们可控制的方式来分离和操作特定的基因。它能创造新的物种能赋予微生物新的机能,使微生物生产出自身本来不能合成的物质,或者增强它原有的合成能力。凡由传统诱变和筛选以及重组育种技术能做到的任何事情,均可用基因工程来做到,但是基因工程做得更好,更有效,更容易成功。重组DNA技术是当今最重要的高新生物技术之一,问世至今已整整三十年,所取得的成果举世瞩目。除了在生物医药领域已经取得辉煌成就外,基因工程也早已渗入传统发酵工业领域,大大提升了发酵工业的技术水平,为这一行业带来十分可观的经济效益,其社会效益和环保效益正日益体现。基因工程在菌种选育上取得的成果令人振奋,对发酵行业的影响不可估量。诸如氨基酸、核苷酸、维生素、抗生素、多糖、有机酸、酶制剂、乙醇、饮料、啤酒等均已采用重组DNA技术构建了重组DNA工程菌,有的早已获准进行专门生产,如细菌α-淀粉酶、凝乳酶、L-苏氨酸、L-苯丙氨酸等。据悉丹麦的诺维信(Novozyme)公司的工业酶已有75%是由工程菌生产的。传统发酵领域里的基因工程菌数量也正在急剧上升。
　　芬兰国家酒精公司(Finnish State Alcohol Com-pany)Vehmaanpera et al.1987年[24]首先报导,从淀粉液化芽孢杆菌中克隆了α-淀粉酶基因,构建了工程菌,工业化生产α-淀粉酶。在以水解淀粉为碳源的工业培养基上,该工程菌所产的α-淀粉酶是传统方法选育菌种的2倍。经60m3发酵罐生产规模发酵考验,发现在生产条件下,90%以上的细胞中带有由质粒编码的α-淀粉酶特性,重组质粒的稳定性是可以接受的。
　　氨基酸是具有重要经济价值的微生物发酵产品,氨基酸中苏氨酸、赖氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸等均可采用基因工程菌生产。
　　重组DNA技术已应用于工业乳酸发酵菌种选育。Picataggio等[25]报导了基因工程菌乳杆菌MONT4的构建。研究者自高温发酵葡萄汁中分离到一株乳杆菌,具有可诱导的戊糖磷酸途径,能把L-阿拉伯糖和D-核糖同型发酵为乳酸。但缺乏同化木质纤维素中木糖所需的关键酶-木糖异构酶(Xylose isomerase)和木酮糖激酶(Xylulokinase)。从植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)中克隆了编码木糖异构酶和木酮糖激酶的基因,将这两个基因引入MONT4,构建了同型发酵工程菌MONT4,可把含有木糖的木质纤维素生物质发酵生成乳酸。其转化率接近理论转化率(约为1.67mol乳酸/1mol木糖)。工程菌还能发酵木质纤维素中的葡萄糖、纤维二糖、甘露糖和阿拉伯糖。　　酶制剂生产方面,重组DNA技术(r DNA)早在1983年即已报导应用。Wells et al.(1983)[26]报导
解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)编码枯草杆菌蛋白酶(subtilisin)基因在枯草杆菌(B.subtilis)I-168中表达,该碱性蛋白酶较亲株增加了200倍。Kaneko et al(1989)[27]把嗜碱性芽孢杆菌Bacillusstrain YaB枯草杆菌蛋白酶(碱性弹性蛋白酶Alka-line elastase YaB)的结构基因引入E.coliMC1061、JM109,在B.subtilisDB104细胞中表达,蛋白酶活力增加17倍。Jang et al(1992)[28]把嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)NCIB10278的枯草杆菌蛋白酶J转入宿主E.coliMC1061、JM109和B.subtilisDB104中,酶活力增加46倍。Feng et al(2001)[29]把带有α-淀粉酶amy基因的pBX96质粒转化至嗜碱性短小芽孢杆菌(B.pumilis)c172宿主细菌中,构建出工程菌B.pumilisc172 - 14(pBX96),与亲株比较,工程菌的碱性蛋白酶生产水平提高了43%,pBX96质粒的引入不仅改变了碳源的利用,即由利用葡萄糖改为利用淀粉,而且也除去了高浓度底物葡萄糖对蛋白酶生产的抑制,解除了分解代谢物阻遏。
　　在发酵工业中,降低氧耗、降低动力消耗对降低生产成本有着重要意义。近来,采用透明颤菌(Vitreoscillasp.)血红蛋白(VHb)基因的克隆及其应用受到普遍重视[30]。透明颤菌的血红蛋白(VHb)存在于专性好氧,但可在贫氧环境中生活的透明颤菌中。由于VHb具有结合氧的特性,从而暗示着在好氧的生物过程中具有潜在应用价值。VHb蛋白在大多数异源宿主中的表达,均可降低重组细胞对溶氧的敏感程度,使之适应较低的溶氧水平,有利于重组细胞的生长和目的产物的合成,因而在发酵工业中具有良好的应用前景,可用来降低能耗及提高产品质量。透明颤菌血红蛋白基因(VHb)已被克隆和测序,并在多种异源宿主中得到表达。例如文莹等(2001)[31]报导,透明颤菌血红蛋白在肉桂地链霉菌中表达,促进细胞生长及抗生素合成。莫能霉素(Monensin)是多醚类离子载体抗生素,由肉桂地链霉菌(Streptomyces cinnamonensis)产生。带完整vhb基因及硫链丝菌素诱导启动子tipA的链霉菌-大肠杆菌穿梭表达载体p HZ1252可以在肉桂地.链霉菌中稳定复制,经硫链丝菌素诱导表达具有生物活性VHb蛋白。VHb蛋白在氧限制条件下,可以明显促进肉桂地链霉菌的菌体生长,促进莫能霉素的合成。
　　(2)蛋白质工程也称定点突变(site-directedmutagenesis SDM),是以蛋白质结构和功能的研究基础,设计新蛋白质的氨基酸序列,应用重组DNA技术设计并构建具有新性质的蛋白质或酶的过程。被视为第二代基因工程的蛋白质工程,现亦普遍用于菌种改良。这种方法是经深思熟虑,通过变动蛋白质一级结构而改变蛋白质的性质,如蛋白酶在高pH和高温条件下获得新的稳定性或底物专一性。SDM用于构建枯草芽孢杆菌蛋白酶变种,其储藏和氧化稳定性得到了改良。Estell et al.(1985)[32]报导解淀粉芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶subtilisin BPN’的一级结构中,位置紧靠催化点丝氨酸221位点的222位点是对氧化作用敏感的甲硫氨酸,它被具有抗氧化作用的氨基酸,例如丙氨酸、丝氨酸或谷氨酰胺所取代,使得蛋白酶免遭因氧漂白(oxygenbleaches)造成的蛋白酶失活。Pantoliano et al.(1989)[33]对蛋白酶BPN’三级结构中分散在不同位置中6个不同氨基酸进行取代(N218S,G169A,Y217K,M50F,Q206C和N76D),发现可增加蛋白酶在温度高达65℃及极端碱性(PH12)的苛刻条件下的稳定性。变异株的失活率比野生型蛋白酶BPN’的失活率慢300倍。Yang et al.(2000)[34]用SDM产生突变型蛋白酶E,60℃热稳定性提高,在2个蛋白酶E分子Ser236Cys间形成一个二硫键,其抗氧化突变酶耐热性较亲株提高了5倍。
　　定向进化(directed evolution,DE)是近年来出现的新的改造酶蛋白质的关键技术。生物界自然进化的关键步骤是突变、重组和选择。在自然界条件下,这个进化过程非常缓慢,DE则是在实验室中模仿自然进化的突变,重组和选择,从而可大大缩短这一进化进程,有效地改造蛋白质,以获取具有重要工业应用价值的新蛋白质(酶),使之适合人类生产和生活的需要。DE采用以下几种手段建立突变体文库:DNA随机重组(DNA改组、DNA洗牌,DNAshuffling)、随机引物重组(random priming recombi-nation)和交叉延伸过程(staggered extension process,StEP)。步骤是先确定一个目标酶,接着克隆出相应的基因,选择一个适合有效的表达系统,对目标基因进行随机诱变和/或离体重组,创造分子多样性,产生突变体文库。由于筛选或选择的条件确定了蛋白质预期特征的进化方向,因此,有效的筛选或选择方法的建立将是决定定向进化成功与否的最关键的因素。目前,DE已在脂肪酶、醛缩酶、海因酶(hydantoinase)、酯酶、天冬氨酸转氨基酶、卡那霉素转核苷酸基酶(kanamycin nucleotidyl transferase)、β-内酰胺酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、酰胺酶(amidase)、岩藻糖苷酶(fucosidase)和枯草杆菌蛋白酶中取得了进展。You & Arnold(1996)[35]报导,采用易错PCR和筛选策略,把枯草杆菌蛋白酶E在有机溶剂二甲基甲酰胺(dimethyl formamide,DMF)中的酶活提高到500倍,酶在有机溶剂中的稳定性有所提高。Zhao et al.(1998)[36]用StEP,把经过一轮易错PCR诱变和筛选得到的5株热稳定性枯草杆菌蛋白酶E变种重组在一起,通过StEP-重组基因文库的筛选,获得一个蛋白酶变种,在60℃时酶的半寿期t1/2增加了50倍。我国肖志壮等(2001)[37]
在DE中采用了一种新的平板筛选策略。首先用定向进化的方法建立瑞氏木霉(Trichoderma reesei)内切葡聚糖酶Ⅲ(endoglucanaseⅢ,GEⅢ)突变体文库,在最适生长条件下培养之后,覆盖能够反映酶解反应的上层(羧甲基纤维素钠,CMC-Na),在需要的非生长条件下进行反应,然后根据水解圈产生速度来判断EGⅢ突变体酶活性,筛选耐碱性或低温酶突变体。结果得到了几株在低温或碱性条件下高活性的EGⅢ突变体。
　　(3)代谢工程(ME)(也称第三代基因工程),由基因工程衍生,是近期非常重要的菌种改良手段。代谢工程一般是多基因的基因工程,与细胞的基因调控、代谢调控和生化工程密切有关。可以通过改变代谢流和代谢途径来提高发酵产品的产量、改善生产过程、构建新的代谢途径和产生新的代谢产物。代谢工程在微生物菌种选育应用的前景无可限量。一个例子是谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glu-tamicum)通过代谢途径分析,采用代谢工程改变代谢流,从而提高了L-赖氨酸的产量。Eggeling et al(1998)[38]报导,谷氨酸棒杆菌提高L-赖氨酸产量的策略是增强赖氨酸生物合成途径中编码二氢吡啶二羧酸合成酶的dapA基因,以增加流向L-赖氨酸的代谢通量(flux)。作者对天冬氨酸族氨基酸生物合成途径(涉及L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-异亮氨酸和L-甲硫氨酸等4个氨基酸)中7个生物合成酶进行了测定,发现对编码这7个酶的基因分别扩增,其中只有dapA基因扩增后,由它控制的二氢吡啶二羧酸合成酶(dihydrodipicolinate synthase,DDP)过量表达,导致赖氨酸的积累从220mmol/L增加到270mmol/L。在各引入相应基因的受体菌中,质粒编码的基因使酶活力过量表达均超过无质粒菌株的6倍以上。但大多数基因的过量表达并未促进L-赖氨酸的积累,其中编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因(ddh)的引入甚至还降低了赖氨酸的积累。只有编码DDP的dapA基因的引入,使DDP过量表达,才明显有利于赖氨酸的积累。DDP位于代谢途径中天冬氨酸半醛向赖氨酸合成或向苏氨酸合成的分支点上,它与由hom基因控制的高丝氨酸脱氢酶(ho-moserine dehydrogenase,HD)竞争其同一底物天冬氨酸β-半醛。由于dapA基因得到增强,向赖氨酸的通量得以增加,而朝向苏氨酸的通量则被削弱。额外dapA基因的导入引起细胞内碳代谢流向DDP过量表达的全局性反应。苏氨酸合成被削弱则导致细胞生长速率的降低,但却增加了来自丙酮酸的缬氨酸和丙氨酸的胞内水平。该研究通过除去一个瓶颈,简单的修改了一条代谢途径,增加了相关酶的活力,在天冬氨酸族氨基酸生物合成途径中,以影响碳通量的流向来影响全局,具有较大价值。
　　突变、重组和基因工程是菌种改良的基本手段和有效工具,其中突变是基础,重组和基因工程离不开突变。例如,用于重组和基因工程所需要的遗传标记材料都要通过突变而获得,尽管基因工程是菌种改良最有效、最有潜力的方法,这几种方法仍然互为补充。例如,采用基因工程菌泡盛曲霉(As-pergillus awamori)生产凝乳酶(chymosin)-酸性蛋白酶,用于奶酪生产,但工程菌产酶量仍嫌不够。Lamsa & Bloebaum(1990)[39]采用突变和选择方法,经5轮诱变,最终使工程菌凝乳酶的产量增加4倍。作者一方面采用UV和NTG等诱变剂,另一方面还采用提高筛选效率的措施,包括菌落限制剂(colo-ny restrictor)2,6-二氯-4-硝基苯胺(2,6-dichlo-ro-4-nitroaniline,亦称dichloran)的使用,便于单菌分离;还用酸性蛋白酶抑制剂重氮乙酰-正亮氨酸甲酯(diazoacetyl-nor leucine methyl ester,DAN),以降低霉菌本身所产酸性蛋白酶很高的背景浓度,从而排除干扰。在琼脂平板筛选过渡到摇瓶培养筛选之间还穿插24-孔培养板的微型化液体培养生长法,作为过渡筛选步骤。用高度专一的96-孔微型滴定板浊度测定法(96-well microtiter plate turbidimet-ric assay)测定。几种方法结合在一起,从而大大提高了筛选效率。
3　结束语
去年春天,人们隆重纪念上一世纪人类生命科学中最重大的科学发现-DNA双螺旋结构发表五十周年。正是因为有了这一伟大的科学发现,才有了生命科学的飞速发展,才形成了今天令人惊叹的生物医药高科技产业群。当代发酵工业也深受DNA双螺旋结构发现之益。作为现代生物高科技支柱和标志的基因工程技术对发酵工业的积极影响日益体现,这种影响首先就在于对工业菌种的强有力的改造。基因工程问世刚踏入第三十一个年头,用基因工程技术改造菌种正方兴未艾。目前困难还很多,还需克服许多技术障碍,重要工业微生物菌种的遗传学研究,代谢途径及其调控知识需要深入,从而为有目的理性的设计,定制人们所需要的“浪费型”菌种打下扎实的基础。基因工程是具有高风险的、高投入的高新技术,在我国,科研院所、大专院校和若干有实力的企业正积极开展此类研究,但尚未普及。在目前条件下,应加强在政府有关职能部门的大力组织和协调,组成协作网络,努力攻关。今天,传统发酵行业更需要注入高新技术,开拓创新;同时,也不放弃现有行之有效的传统育种手段。诱变育种、遗传重组等传统技术需要推陈出新。传统技术和高新技术有机结合,选育高产、优异性能的菌种,参与国际竞争,为我国的发酵行业的新腾飞作出努力。