工业菌种改良述评(一)
2007-10-04 11:12:39   来源：工业微生物   评论：0 点击：

　　微生物发酵要想取得优良成绩,有赖于优良菌种的利用。人们已经熟知,生物体的表型是由其遗传型和环境条件相互作用所决定的。因而,从工业发酵的观点来看发酵菌种的优异生产性能等于经选育的、符合经济要求的优良遗传背景加上经人为精心设计的、优化的发酵环境。菌种选育的最终目标,就是通过人工干预,使选出的优良菌种在优化环境中尽可能表现出优异性状。菌种分离、筛选、改良是贯彻微生物发酵始终的工作。本文就此作一简要回顾。
1　微生物菌种选育的必要性和具体目标
1.1　大自然中蕴藏着无数具有实际或潜在应用价
值的微生物资源,源源不断的开发微生物资源是人类社会持续发展的必由之路。由于现代社会经济的高速发展,人口、资源、能源、环境等问题日趋严重。迫于这样的压力,人们对微生物资源的需求日益增加,开发步伐随之加快。但是,虽然大自然中微生物资源异常丰富,但人们知道的微生物种类大约仅为总数的10%,而真正被利用的还不到1%,进一步开发利用的潜力很大[1]。
1.2　菌种技术的进步是发酵工业发展的重要依托。微生物菌种来源于自然。在长期的进化过程中,微生物形成了一整套精密的代谢控制机制,不会过量生产超过其自身生长、代谢需要的酶或代谢产物。微生物细胞内具有反馈抑制、阻遏等代谢调控系统。育种工作者的任务是设法在不损及微生物基本生命活动的前提下,采用物理、化学或生物学以及各种工程学方法,改变微生物的遗传结构,打破其原有的代谢控制机制,使之成为“浪费型”菌株。同时,按照人们的需要和设计安排,进行目的产物的过量生产,最终实现产业化的目的。
1.3　菌种选育改良的具体目标包括
(1)提高产量。生产效率和生产效益总是排在一切商业发酵过程首位的目标。
(2)提高产物的纯度,减少副产物;提高有效组分;减少色素等杂质。
(3)改变菌种性状,改善发酵过程,包括:改变和扩大菌种所利用的原料结构;改善菌种生长速度;提高斜面孢子化程度;改善菌丝体形状,采用菌球菌丝体发酵;少用消泡剂或使菌种耐合成消泡剂;改善对氧的摄取条件,降低需氧量及能耗;耐不良环境:抗噬菌体的侵染,耐高温、耐酸碱、耐自身所积累的代谢产物;改善细胞透性,提高产物的分泌能力等。
(4)菌种的遗传性状,特别是生产性状稳定。
(5)改变生物合成途径,以获得新产品。
2　获取优良菌种的有效途径
广义上说,菌种改良可描述为采用任何科学技术手段(物理、化学、生物学、工程学方法以及它们的各种组合)处理微生物菌种,从中分离得到能显示所要求表型的变异菌种。菌种改良的基本途径:突变和选择;基因重组(遗传重组)和基因工程(遗传工程)。
2.1　传统的(“经典的”)诱变及筛选是最常用的菌种改良手段。关键的第一步是用物理、化学或生物的诱变因子修改目的微生物的基因组(genome),产生突变型。微生物的自发突变频率在10-5~10-8之间,经诱变剂处理微生物细胞后,可大幅度提高突变频率,达到10-3~10-6,这比自发突变提高了上百倍。
(1)菌种选育常用的诱变剂
　　菌种选育常用的诱变剂见表1。
 

　　另外,在实践中也还有用抗生素作为诱变剂的实例。根据抗生素对微生物菌种具有生物学效应,如用制霉菌素(nystatin)处理产黄青霉,可引起细胞质膜渗透性变化,促进硫酸盐的摄入,增加青霉素的合成;把专一性作用于DNA的抗肿瘤抗生素丝裂霉素C处理春日霉素产生菌,可得到高产突变型。
　　(2)诱变育种中考虑的若干因素
　　诱变剂的作用是扩大基因突变的频率,因此应选择高效诱变剂如NTG、60Coγ-射线、UV等;考虑诱变剂的种类、剂量、处理时间等诱变条件;诱变剂对DNA损害的类型和损害的程度;两种以上诱变剂的复合处理;诱变后的处理条件;被处理微生物的生理状况:处理的是营养体细胞、休眠体芽孢、分生孢子还是除去细胞壁的原生质体;细胞是单核还是多核;菌种对诱变剂的敏感性和同一种诱变剂处理同一菌种的次数(频率)以及每次诱变处理后菌种产量提高的幅度以及其他性状的改进等。
　　当前发酵工业中使用的高产变异菌株,大部分都是通过诱变而大大提高了生产性能的菌株。诱变育种具有方法简便、快捷和收效显著等特点,所以仍然是目前被广泛使用的主要育种方法之一。
　　(3)诱变育种在菌种改良上的成绩
　　诱变育种在菌种改良上的成绩非常显著。人们不会忘记青霉素的发酵水平的提高[3]。Flemin在上世纪二、三十年代最初发现青霉素时,发酵单位仅为2 IU/mL。到八十年代中期,坚持不懈的菌种改良,终使青霉素的效价攀升到85 000u/mL,按重量计,从最初发现时的0.0012g/L提高到了50g/L。
再如L-谷氨酸的发酵,五十年代木下祝郎等发明的谷氨酸微球菌(Micrococcus glutamicus),发酵生产L-谷氨酸时,发酵产酸水平为5%,如今工业生产产酸水平已达到15%,转化率高达60%~65%。
　　在微生物发酵新产品源源不断涌现的今天,诱变育种仍然是最常用的基本技术。诱变处理的目标是以选育高产量、高发酵强度、能利用各种不同原料、适应特殊发酵条件、减少副产品以及低溶氧、低能耗的菌种。浏览近期的有关专业书刊杂志,通过诱变方法提高菌种产量、改良生物性能的报告仍然比比皆是,以下是一些例证:
　　朱亨政(1991)[4]报导,用酸性薯干粉平板自土壤样品分离野生型黑曲霉Aspergillus niger628,经多次60Coγ-射线及DES诱变,得到产柠檬酸变异株Co827,产酸12%~13%,转化率95%,发酵周期54~64 h,发酵强度:1.8~2.0 kg/(m3·h),继而又由Co827反复进行60Coγ-射线诱变处理,得变异株Co8-60-7,实验室摇瓶产柠檬酸可达23%以上,转化率100%,发酵周期不超过120 h(孢子接种)。在6m3发酵罐中试时,连续五批,平均产酸19.05%,转化率95%,发酵周期117.8h(孢子接种)。大生产产酸可达18%以上,发酵周期79h,转化率97.2%。
　　涂国全等(2002)[5]报导,南昌链霉菌(Strepto-myces nanchangensis)NS-41-80产多种杀虫活性物质,其中B1组分的母核与广谱驱虫抗生素-阿维菌素(Avermectins)相同,侧链结构则完全不同,是我国发现的广谱高效新抗梅岭霉素(Meilingmy-cin,MB),按照抗生素产生菌中抗性基因与抗生素合成的结构基因和调控基因紧密连锁容易发生共突变(co-mutation)的理论,作者在对诱变出发菌株的孢子进行抗链霉素致死测定的基础上,采用化学诱变EMS处理孢子,使其DNA产生高频率突变,然后将突变的孢子涂布在含有链霉素致死浓度的培养基平板上进行培养,获得链霉素抗性基因(str)突变株,从中筛选梅岭霉素高产菌株,使摇瓶发酵单位提高了77.9%。菌株的抗药性突变与产量突变密切相关。诱变处理后筛选出链霉素抗性基因突变株,大大减轻了初筛工作量,提高菌种选育的工作效率。这种育种思路以相当惊人的高频率获得高产菌株,可为提高抗生素生产提供一个方便有效的方法。
　　ε-聚L-赖氨酸(ε-poly-L-Lysine,ε-PL)是日本Shima & Sakai(1977)自小白链霉菌(Streptomycesalbulus)346发酵液中分离得到的一种聚氨基酸,是一种出色的新颖食品保鲜剂,可广泛用于肉类、家禽、海产品、面包、饼干和各种谷类食品的保鲜,因其高吸收性,也用于妇女卫生巾、婴儿尿片和其他各种工业产品。日本已建成一条年产千吨级的ε-PL生产线。Hiraki et al.(1998)[6]选育了Str.albulus346菌的AECr+Glyr(甘氨酸抗性)突变型。野生型346菌中L-赖氨酸可造成对L-赖氨酸生物合成至关重要的天冬氨酸激酶的部分阻遏,而甘氨酸则抑制天冬氨酸激酶的活性。AECr+Glyr突变型中,90%突变型是高产ε-PL菌,其中突变型11011A小试中最大产量是2.11mg/mL,比野生型菌株高出10倍。在3升发酵罐中,120h,11011A产20mgε-PL/mL,对葡萄糖转化率8.9%。工艺条件包括葡萄糖和硫酸铵流加,pH控制等。
　　以上所举的三个例子说明,目前诱变仍然是工业微生物遗传育种不可或缺的基本手段。诱变筛选方法相对简便,是菌种选育的基本、常规和“经典”方法。和其他技术领域的进步一样,诱变和筛选技术不断汲取范围广泛的各门学科新技术而得到发展,成为广大育种工作者乐于采用的首选技术。
(4)新诱变因子及诱变技术的开发
　　新的诱变因子不断被发现并得到应用,诱变技术也得到不断的发展。
　　①新的诱变剂-低能离子束及其在微生物育种中的应用:
　　离子注入是20世纪80年代兴起的一种表面处理技术。中国科学院等离子体物理研究所余增亮等[7]首先把离子注入这一高新技术应用于农作物品种改良,并获得成功。由此开始了注入离子与生物体系相互作用过程的探索。这种相互作用过程大致分为能量沉积、动量传递、离子注入和电荷交换等四个原初反应过程,在10-19~10-13s中间时发生。荷能离子注入除具有γ-射线能量沉积引起机体损伤的特征外,还具有动能交换产生的级联损伤,表现为遗传物质原子转移、重排或基因的缺失。还有慢化离子、移位原子和本底元素复合反应造成的化学损伤以及电荷交换引起的生物分子电子转移造成的损伤。离子注入通常采用N+、H+和Ar+,而且效果是N+>H+>Ar+,采用N+离子注入,N+离子不仅构成生物体基本元素,而且N的位置,共价键数可区别不同碱基。离子注入生物学效应显示出一些不同于辐射生物学的特征,相当于物理和化学诱变两者相结合的复合诱变效应。作用于生物体,其损伤轻,突变率高,突变谱广。但是离子注入机理非常复杂,真正阐明尚有待时日,但利用这一技术进行微生物育种则已受到越来越多的关注,并已取得相当良好的业绩。下面举几个实例:
　　姚建铭等(1999)[8]采用N+离子注入诱变利福霉素生产菌地中海拟无枝菌酸菌(Amycolatopsismediterranei),先用利福霉素浓度梯度平板理性化筛选出高抗性菌株,用N+离子注入诱变筛选,初筛摇瓶效价达9000u/mL,经复筛获得诱变菌株2953#,效价稳定提高18%,7m3罐中试和30m3罐生产实验,均有效好业绩。
　　张鑫等(2002)[9]采用10KeV能量的N+束,对产类胡萝卜素的红酵母RhodotorulaRY-3进行诱变,获得高产类胡萝卜素红酵母菌株RY-3-9。其产率较出发菌株RY-3提高了76.2%,孙建荣等(2002)[10]采用离子束注入对衣康酸产生菌土曲霉(Aspergillus terreus)A 9003进行诱变改良。氮离子注入A9003,在2%LiCl抗性平板上筛选到一株能在39℃发酵的衣康酸高产菌株128#-4。该菌株在30L发酵罐发酵产酸7.5%,转化率60.1%,发酵周期仅50h,性能指标均优于出发菌株A9003。涉及微生物发酵产品的还有长键二元酸、不饱和脂肪酸、糖化酶、乳酸、维生素C前体2-酮基古龙酸、碱性蛋白酶、之江菌素、利福霉素、麦角甾醇等等不下几十种,相信以后低能离子束技术应用面还会越来越广。
　　②近年来,激光辐射诱变和微波电磁辐射诱变亦颇受注意。激光是一种量子流,光微粒。激光辐射通过产生光、热、压力、电磁效应综合作用,直接或间接影响生物有机体,引起DNA或RNA改变,导致酶激活或钝化,引起细胞分裂和细胞代谢活动改变。微波辐射属于低能电磁辐射的一种,其量子能量在10-28~10-25J,对机体的作用机理是场力(非热效应)和转化能(热效应)的协同作用,从而引起生物体突变。胡卫红等(2000)[11]采用微红色CO2激光处理酿酒酵母(S.cerevisiae)AS2.1189-糖蜜酒精发酵酵母,筛选到产乙醇含量有较大变化的辐射变异菌株。通过对这些辐射变异菌株的乙醇脱氢酶同工酶(乙醇发酵中的重要酶)的比较分析发现,其酶谱与未经CO2激光辐照的对照菌相比,都有所不同,证实CO2激光确实对酿酒酵母有诱变作用。本研究表明工业上利用红外CO2激光对酿酒酵母进行诱变育种有发展前景,其它微生物育种也可借鉴。
李永泉等(1998)[12]开展微波诱变和激光诱变相结合选育金霉素链霉菌的研究。金霉素链霉菌(Str.aureofaciens)HMOI是经UV和乙烯亚胺诱变得到的产四环素和金霉素变异株。采用激光和微波诱变处理以提高产去甲基金霉素的能力。作者得到产量高的一株变异株HL-11,去甲基金霉素效价由2831u/mL提高到4683u/mL,提高幅度为65.4%。李乃强等(2001)[13]对宇佐美曲霉(A.usamii)进行UV、微波、60Coγ-射线的逐级诱变育种,使酸性蛋白酶产量从2800u/mL提高到7200u/mL。
　　③多年来为提高诱变效率,育种工作者在诱变方法上作了不少改进。其中尤以原生质体诱变的效果比较突出。由于原生质体对理化因素的敏感性比营养细胞或孢子更强,诱变剂的诱变效率便得到了提高。有的真菌在实验室条件下,不易产生单个分生孢子,给诱变及诱变后突变型的分离带来困难,因而可制成原生质体诱变。又如一般的食用菌具有菌丝体多核、担孢子壁厚的特点,诱变效果不佳。用脱壁酶处理后,原生质体对诱变因子的敏感性增强了,从而增加了变异的机会,提高了诱变率。小诺霉素(sagamicin)是由棘孢小单孢(Micromonospora echi-nospora)突变株在代谢过程中产生的氨基糖甙类抗生素。杨丽等(2000)[14]对该菌进行诱变。经诱变及发酵工艺调控,小诺霉素主要组分C2b含量逐步上升。作者将A-23菌株进行原生质体UV照射、电诱导融合,再生、激光照射,化学物质诱变等复合方法处理,筛选出发酵效价高,主组分C2b含量亦高的菌株MS-116。其发酵后小诺霉素C2b含量为85%以上,效价由950u/mL提高到1320u/mL;30吨罐生产时为1257u/mL。C2b比亲株A - 23提高了71.2%,效价提高32.3%,发酵指数提高38.2%,简化了工艺,提高了效率。在实验室条件下,麦角菌(Claviceps purpurea)不易产生分生孢子。朱平等(2000)[15]将麦角菌菌丝脱壁,制成原生质体,用NTG诱变,并结合筛选方法的改进,即把试管摇床培养、24孔板和常规总碱测定方法(VanUrk蓝色反应)三者结合起来,筛选麦角菌诱变后麦角隐亭(egocryptine)高产突变株,有效地提高了筛选速度和成功率,得到相对产率较高的突变菌株。
　　④诱变时增变因子(助变剂)等的作用:
　　在诱变处理时,往往添加一些助变剂,以提高诱变的效果。(氯化锂(LiCl):本身并无诱变作用但与一些诱变因子一起使用便具有协同作用。采用LiCl同UV、乙烯亚胺复合处理,LiCl进入细胞,吸收UV的能量后,与DNA分子结合,增强了UV的诱变效应。(光敏化剂8-甲氧基补骨酯素(8-methoxypsoralen,简称8-MOP),本身不是诱变剂但在长波长UV作用下,光敏化剂可以吸收大能量而与DNA分子中的胸腺嘧啶结合。光敏化剂的呋喃环与胸腺嘧啶的5、6位形成加成物,导致AT→GC碱基对的转换而引起突变。(在诱变育种中有的研究者还采用咖啡因作为诱变稳定剂。如D-乳酸生产菌的选育。
　　⑤筛选─菌种选育成败的关键步骤筛选是诱变后的关联步骤,是决定菌种选育效率的关键步骤。细胞群体经过诱变处理后突变发生的频率虽比自发突变发生的频率高得多,但是在整个细胞群体中,其频率仍嫌太低,即发生变异的细胞绝对数很低。DNA链上突变的发生是随机的,所需要的突变株出现的频率就更低,寻找所需突变型犹如“大海捞针”。因此合理的筛选程序与方法在菌种选育上非常重要。诱变是随机的,但选择是定向的诱变后需通过正确、灵敏、快速的筛选检测方法,从大量未变和负变的群体中把仍然是很少量的正向突变挑选出来。常用的随机筛选法是逐个检查、测定经诱变处理的存活菌的产量或其他性状。如抗生素产生菌选育中常用的方法,这种方法工作量很大,花费时间多,随机性大,费用也高,但可能是目前提高工业菌株生产率的较好办法。为了以最少的工作量,在最短的时间内取得最大的筛选效果,要求设计并采用效率高的科学筛选方案和手段。