工业菌种改良述评（二）
2007-10-04 11:25:20   来源：工业微生物   评论：0 点击：

　　为加快筛选速度,通常采用下列几种方法:(平皿快速检测法:利用菌体在特定固体培养基平板上的生理生化反应,将肉眼观察不到的产量性状转化成可见的“形态”变化,包括纸片培养显色法、变色圈法、透明圈法、生长圈法和抑制圈法等。
　　(形态变异的利用:微生物的形态特征及生理活性状态与微生物的代谢产物生产能力有一定关系。有时,菌体的形态变异与产量的变异存在着一定的相关性。可以利用这种对突变型的形态、色素和生长特性的了解和判断作为初筛的依据。
　　(计算机技术的应用:由于现代计算机技术的发展,计算机技术和生物技术相结合,已能用于菌种的筛选。例如,我国阳葵等(2000)[16]以分形和多重分形理论为基础,以计算机图像识别技术为手段,对霉菌绿僵菌(Metarhiziumsp.)菌落形态进行了定量描述。发现菌落的生长形态特征与菌种性能好坏有一定的对应关系。根据多重分形特征与菌种性能相关性设计的分类器,可以用于优良菌种的自动识别,速度快,与人工分离筛选的实验数据相吻合。
　　(高通量筛选(High throughput screening):这种方法是将许多模型固定在各自不同的载体上,用机器人加样,培养后,用计算机纪录结果,并进行分析,使筛选从繁重的劳动中解脱出来,实现了快速、准确、微量,一个星期就可筛选十几个、几十个模型,成千上万个样品。
　　合理利用资源配置的自动筛选仪器,可以用最少的资源筛选大量的经诱变的群体。微量化仪器和自动操作系统已经用于菌种筛选。优点是培养基可自动灌注、清洁,可在短时间里进行大量筛选,从而提高了工作效率。随后,使用机器人、计算机数据处理分析,优选出所需的目的菌种。不过,自动筛选仪器的一次性设备投资费用很大,特别是机器人的使用,设备的保养费和软件的费用也不菲。杜邦公司Stieglitz和DeFelice(1986)[17]推介了一套培养基分配、接种和复制的机械装置,用于酵母Yarrowia li-polytica突变型的分离和鉴定。(分析方法的利用分析方法对于检出高产或其他优异性状的菌种也至关重要。所采用的分析方法要兼顾测定的精确性及受制于人力和时间的分析速度。分析方法包括酸碱滴定等常规的方法。化学分析、生物测定、放射免疫测定、色谱法、TLC、HPLC等力求做到测定精确、可靠,尽量减少变异性和假阳性。
　　FCCS法是近年发展的流式细胞术(flow cy-tometry)和细胞分拣(cell sorting)相结合的方法的缩写。FCCS可以有效分析单个细胞中代谢物的含量。被荧光染色的细胞受强激光(一般为氩离子激光器)照射后发出荧光及散射光。通过自动检测荧光和散射光可对细胞进行定性定量分析。这种技术称为流式细胞术,所用的仪器就称为流式细胞仪(flow cytometer)和能自动分选目的细胞的细胞分选器(cell sorter)。一个成功的例子是An G-Het al.
(1991)[18]用FCCS测定细胞中类胡萝卜素的含量。从经NTG处理后的酵母细胞中分拣得到细胞中类胡萝卜素含量超过出发菌株10000倍的超产突变型。
　　⑥理性化筛选(rational screening)技术的应用:
　　随着遗传学、生物化学等学科的发展,人们已逐渐了解重要工业微生物菌种的遗传背景和代谢途径。运用已掌握的遗传学和生物化学方法,科学设计选择性“筛子”,就可以轻易地把大部分不符合要求的菌株经过第一轮预筛就淘汰掉,使具有有效性状的突变株很方便地筛选出来,从而大大提高了筛选效率。这种方法就是理性筛选。可以通过预先精确设计,使突变型带上某些遗传标记,在外观表型上,突变菌株与大量未突变菌株可以明确区分开来。通过预筛选,就能方便地得到所需类型的突变型,再通过摇瓶试验,确定有潜力的菌株,进一步加以改良,最终得到符合生产要求的高产菌株。这种方法可以大大节省劳动力,提高筛选效率。
　　(营养缺陷型的应用
　　氨基酸发酵是理性育种应用的典型实例。人们对氨基酸的生物合成代谢途径已经了解得比较清楚。
利用微生物发酵生产氨基酸的关键是解除细胞的反馈调节,从而使所需氨基酸可以过量生产。常用的一
个办法是通过诱变以获得营养缺陷型。如谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)发酵生产L-赖氨酸的例子。以葡萄糖为碳源,赖氨酸是天冬氨酸族分支代谢途径的四种代谢终产物之一。另外,这条代谢途径也导致苏氨酸、异亮氨酸和甲硫氨酸的合成。由代谢产物苏氨酸和赖氨酸共同反馈抑制这条代谢途径中的一个关键酶-天冬氨酸激酶。当这两种氨基酸的积累量超过微生物细胞需要时,就会通过共同抑制该酶的活力来关闭它们的合成。经诱变,得到一类突变型,编码高丝氨酸脱氢酶的基因发生突变,酶活力丧失,从而使细菌不能生成苏氨酸(共同抑制产物之一)和甲硫氨酸。把这一营养缺陷型培养在苏氨酸和甲硫氨酸含量刚够维持细菌生长的培养基中,此时苏氨酸含
量还不足以和赖氨酸一起共同抑制天冬氨酸激酶的活力,赖氨酸的合成得以持续进行。
　　(回复突变型的应用
　　大多数抗生素产生菌发生营养缺陷后,其抗生素产量往往变得很低,甚或是无产量菌株。这种缺陷在其他方面却是正常的或接近正常的菌株。一旦再经另一次诱变发生回复突变后,得到原养型回复子,抗生素产率很有可能得到提高。如从四环素和金霉素产生菌的营养缺陷型回复突变株中得到抗生素高产菌种;根瘤菌的色氨酸缺陷型经回复突变后,恢复致瘤能力等。
　　(代谢类似物抗性突变型的应用
　　许多微生物代谢终产物在细胞中积累,往往会抑制代谢途径中的酶活力。终产物通过与酶的特定结构部位(变构部位)结合,引起酶的构象变化,从而抑制酶的活性。这种结合通常是非竞争性的。终产物脱敏突变型的结构基因中发生的突变使酶-结合部位发生改变,从而阻止了这种抑制作用。突变型便能过量产生所需终产物。以赖氨酸发酵为例,谷氨酸棒杆菌对赖氨酸的结构类似物S-(β氨乙酰基)胱氨酸(AEC)敏感,是赖氨酸毒性类似物。它能抑制合成途径中的天冬氨酸激酶,但不能参与蛋白质的合成。当细胞在含有AEC的培养基中培养时,野生型菌株由于得不到赖氨酸营养而遭淘汰,抗AEC突变型则因编码天冬氨酸酶结构基因发生了突变,变构酶调节部位不再能与代谢拮抗类似物相结合,而其活性中心却不变,这种突变型在正常代谢时,最终产物与代谢类似物结构相似,故也不与结构发生改变的变构酶相结合,这样,这种抗反馈调节突变型对产物抑制脱敏,仍有正常的催化功能,从而过量生产赖氨酸。另外,调节基因发生突变,使阻遏物结构改变,不能与代谢类似物相结合,这种突变型亦是类似物抗性突变型(也是抗阻遏突变型),其正常代谢终产物同样不能与结构发生改变的阻遏蛋白相结合,仍能不断合成有关的酶,从而过量生产所需的代谢物。
　　在育种实践中,往往是使突变株带上营养缺陷和抗代谢类似物两种类型的遗传标记,而且也不限于只带上一种营养缺陷和一种抗性,产量则随着这类标记的增加而增加。可以是多重营养缺陷和多种类似物抗性。
　　如富英华等(1998)[19]报导L-赖氨酸高产菌株FH128的选育谱系,见表2。

　　上表表明L-赖氨酸的合成因营养缺陷型和调节突变型的使用而产量增加,两者结合起来进一步提高了L-赖氨酸发酵水平。另外,增加酶缺陷(如丙酮酸激酶)和低活力水平的酶(柠檬酸合成酶)之类遗传标记,亦能促进赖氨酸产量的进一步提高。
　　这种理性育种方法在L-精氨酸、L-瓜氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-甲硫氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸、L-苏氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-缬氨酸等高产菌种选育上同样都获得了成功。核苷酸类物质的高产菌种也通过相同的原理及添加相应的标记而选育得到。
　　(其他常用的突变型,还包括抗阻遏突变型、组成型突变型、细胞膜透性突变型、条件致死突变型、耐盐突变型等等。现以耐盐突变型为例。Songet al.(2000)[20]报导从大肠杆菌K12中分离到解除终产物对天冬氨酸激酶的阻遏和抑制的突变型菌株HS3,其遗传标记是Met-、AHVr(抗α-氨基β-羟基戊酸)、IleL(异亮氨酸渗漏型)、AECr,但HS3既不耐盐(4% NaCl)也不耐高渗透强度。培养基中加入大于2%浓度的NaCl,葡萄糖浓度超10%,HS3
菌株的生长和产酸就被严重抑制。在工业氨基酸发酵中,代谢终产物的大量积累会建立一种高渗透强度,影响生长和产酸,造成微生物生长和呼吸率的下降。HS3细胞经NTG处理,选出耐盐(4%NaCl)突变型HS528。当葡萄糖浓度达到10%~12.5%时,HS528的生长和L-苏氨酸产生上升。在5L发酵罐流加发酵中,HS528产L-苏氨酸74.0g/L。亲株HS3则为58.0g/L。最明显的变化是,在这种条件下,HS3产大量醋酸,突变型则很少;亲株不产脯氨酸,而突变株HS528产93mg/L脯氨酸。细胞中脯氨酸积累消除了渗透强度,突变型的醋酸积累量也大大少于亲株。
2.2　基因重组(遗传重组)是菌种改良的另一重要途径
　　凡采用杂交、接合、转化和转导等遗传学方法,把两个不同形状个体内的基因放在一起,经遗传交换(crossing over),重新组合后,改变遗传结构,形成新的遗传型个体的过程,称为基因重组或遗传重组。通过这种手段,增加优良性状的组合,或者导致多倍体的出现,从而获得性能优良的生产菌种,在工业微生物育种工作中占有重要地位。但是由于若干重要工业微生物的杂交、有性世代等尚未揭示,(如柠檬酸产生菌黑曲霉等有性生殖世代尚未发现),在很大程度上妨碍了杂交手段的实际应用。因此,与诱变育种相比,杂交育种的研究报导数量相对较少。
　　(1)杂交育种
　　在基因重组的研究中,比较成功的是酵母菌。很早就发现,酵母菌中具有单倍体和二倍体的生活史,存在孟德尔式分离现象,存在着a和α交配型。因此有条件通过杂交来达到基因重组的目的。
　　卡尔酵母(S.calsbergensis)可以把糖类转化成酒精和二氧化碳,但它只能发酵麦芽糖或发酵液中80%左右的糖类。而糖化酵母(S.diastaticus)能发酵糊精。把它们杂交,可以产生能发酵糊精的杂种。但杂种所酿制的啤酒口味不佳,因为糖化酵母中存在着一种使啤酒产生异味的‘pof’(苯酚味异味)基因,控制阿魏酸(ferulic acid)形成4-乙烯基愈创木酚(4-vinyl guaiacol),造成啤酒产生怪味。因而把杂种亲本之一卡尔酵母进行杂交,得到能转化90%糖的杂种(此时已不带pof基因),酿制的啤酒就比较适口。然而育种并未终止。研究者再把这一杂种同能发酵异麦芽糖的野生酵母杂交,产生能把糖100%转化的杂种。随后又进行多次互交及选择,就能得到性能更好的杂种。这样的杂种酵母菌能用来酿制专供糖尿病人喝的无糖的极“淡”的啤酒[21]。
　　(2)准性重组育种
由于在重要工业微生物尤其是丝状真菌中遗传背景不够清楚,大多数真菌的有性世代尚未揭示,或者即使存在有性世代,其杂交重组频率也很低。因此在很长一段时间里,用基因重组育种手段来进行丝状真菌的育种尚不普遍。转而则是采用准性重组育种。在柠檬酸生产菌黑曲霉中,曾把两个分别适合于深层发酵和半固体发酵的菌株进行准性融合,在由此产生的二倍体菌株和单倍重组体中,可筛选得到产生优于两个亲本的柠檬酸生产菌种。又如灰黄霉素产生菌-荨麻青霉(Penicillium urticae)曾采用准性重组进行育种,通过选择营养缺陷型亲本,人为强制两菌株形成异核体,检出稳定的杂合二倍体。再辅以采用UV、γ-射线或氮芥等理化因素处理杂合二倍体所产生的分生孢子,促使其发生染色体交换。染色体在子细胞中分配不均,染色体畸变或点突变等,从而使分离后的杂交子代(单倍体杂合子)进一步增加新的性状,加大获得高产菌株的可能性。
　　(3)原核生物的基因重组———接合、转化和转导等也用于微生物菌种选育,以转化为例,转化是原核生物基因重组的一种方式。从一种生物细胞抽提出裸露的纯DNA(转化因子),再被另一种细胞所吸收,并整合进细胞染色体,受体细胞基因型和表型发生相应变化的现象。使受体处于最容易吸收外源DNA并实现转化的感受态,是实现转化的重要条件。转化现象首先在肺炎球菌中发现,随后又在枯草杆菌和淋球菌等中发现。经钙处理(或加入环腺苷酸,cAMP),大肠杆菌、酵母菌亦都可以进行转化。破除细胞壁的原生质体也广泛用于转化。转化更是基因工程的基础技术之一。在枯草杆菌中曾育成α-淀粉酶提高的转化菌株。枯草杆菌的amyR3、amyS、papS1、Tmr和papM118突变各自提高野生型枯草杆菌α-淀粉酶活力水平2~7倍,经转化,把这5个能提高α-淀粉酶的基因引入野生型Marburg6160菌株中,带有全部5个基因的转化子菌株产α-淀粉酶是野生型的250倍[22]。
　　(4)原生质体融合技术
微生物细胞存在着一道天然屏障———细胞壁,造成细胞与细胞之间缺乏联系和沟通的渠道,从而不能进行遗传物质的传递和交换。一旦用溶菌酶、纤维素酶、蜗牛酶等脱壁酶把细胞壁除去,便能使原生质体接触、融合。高效促融合剂如聚乙二醇的存在,渗透稳定剂的存在以及原生质体再生细胞壁的条件等,均是原生质体融合成败的关键。原生质体高频率重组可以在原本很少或者不能进行遗传交换的两种不同微生物之间发生。原生质体融合可以在种内、种间、属间发生。通过这一技术,可以把许多需要的性状汇集在同一个细胞里。
　　原生质体融合技术在工业发酵中的应用相当普遍,包括:①高产菌株的选育,如氨基酸、有机酸、抗生素、酶制剂、维生素、核苷酸、乙醇等工业菌株的选育;②把参与融合双方的优良性状结合在一起,如把高产与生长缓慢的菌株同低产但生长迅速的菌株进行融合,以得到既高产又迅速生长的融合子。也可以通过原生质体融合来扩大发酵原料的利用范围,如酿酒酵母不能利用淀粉与糊精生产酒精,糖化酵母能利用淀粉与糊精,将两者融合,就可以得到既能利用淀粉和糊精,又能生产酒精的融合子酵母;
③利用原生质体融合可以合成新产物,如紫色链霉菌能产紫霉素B1,吸水链霉菌能产生保护霉素,两
者的阻断突变型融合后,构建出一株重组菌株,产生一种新的抗生素-杂种霉素。
　　Kirimura et al. (1997)[23]报导,曲霉属中土曲霉(A.terreus)和宇佐美曲霉(A.usamii)的种间原
生质体融合。土曲霉是衣康酸产生菌,宇佐美曲霉则产葡糖淀粉酶。采用种间原生质体融合,育出一株可由淀粉作碳源产生衣康酸的新曲霉。由土曲霉IF06123选得Met-营养缺陷型TM-69,而宇佐美曲霉IAM 2185选Lys-缺陷型VM-16,均作遗传标记。两株缺陷型制备原生质体后,在促融合剂聚乙二醇6000促融合得融合子。其分生孢子的DNA含量和细胞核数目分析表明,融合子像亲株一样是单倍体的。其中一株稳定的融合子F-112,形态上类似土曲霉亲株,在可溶淀粉培养基(120mg/mL)培养6d,最高可产35.9mg/mL衣康酸。这一产率5倍于土曲霉亲株并达到土曲霉自葡萄糖为碳源(120mg/mL)生产衣康酸产率的70%。