产纤维素酶细菌原生质体制备条件初探
2008-02-09 12:42:37   来源：本站原创   评论：0 点击：

植物通过光合作用,生产地球上最丰富、最廉价的纤维素资源, 由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造,其外围又被木质素层包围着,要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难,所以到目前为止仍没有得到很好地利用。有资料表明,全世界每年的植物体生成量高达1500亿吨干物质,其中纤维素及半纤维素的总量为850亿吨^[1]。早期水解纤维素主要采用酸水解法，由于要求条件高，产率低，以及对环境有污染，现已被淘汰。近年来，随着生物技术的迅速发展，鉴于酶的催化高效性，人们开始试图利用纤维素酶来水解纤维素，然而纤维素酶并不是一种简单的酶，而是由若干种互相关联的酶组成的相当复杂的酶系。由于组成的复杂性，使得提纯困难，从而导致人们对其性质的研究很不透彻^[2]。

原生质体融合是一种重要的微生物育种技术，通过原生质体融合，使两个菌株的遗传物质得到重组，从而形成稳定的可表达的兼具两个亲本优良性状的菌株；把原生质体进行诱变处理，会比用完整细胞处理更敏感；由于原生质体去除了细胞壁的障碍，但又保持着完整的内在结构，兼备了无细胞提取液和完整细胞的特点，又克服了它们的缺点，故可运用于各种代谢产物的生物合成及某些生物转化和分离。原生质体制备及再生是进行原生质体融合的前提，为进一步融合奠定了基础^[3、4]。

我们从海南岛尖峰岭凋落物中筛选出一株具有纤维素降解功能的野生细菌JJQ1—3，为了选育出更高纤维素降解率的变异菌株，加强对纤维素的降解，对它的原生质体的形成和再生进行了研究，以期得到进一步的开发和利用。对解决当前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有一定的意义。

1.材料

1.1 菌种来源  菌株JJQ1—3,为海南师范大学生物系实验室保藏菌种，自海南岛尖峰岭凋落物中筛选所得，具有高产纤维素酶性能。

1.2 培养基

1.2.1 基本培养基

   牛肉膏蛋白胨固体、液体培养基^[5]

1.2.2再生培养基  牛肉膏蛋白胨固体培养基分别添加0.7M KCl 、0.53M 蔗糖、0.75M甘露醇^[6]。

1.3原生质体制备液

PBS缓冲液^[6]:0.2M 磷酸盐缓冲液(8ml0.2MNa₂HPO₄+92ml0.2MNaH₂PO₄),PH=5.8 ,含0.8M 山梨醇。

1.4 酶液：用PBS配制1mg/ml、5 mg/ml 、10 mg/ml溶菌酶(1000U/mg)。

2.方法

2.1菌种培养

2.1.1菌种活化  取一环保藏菌种划线于基本培养基斜面，培养活化1天，共两次。

2.1.2菌种液体培养  取斜面活化菌种一环，接种于装有50ml液体培养基的三角烧瓶中，120r/min，37℃振荡培养24h,然后以10%接种量接入装50ml液体培养基的150ml三角烧瓶中120r/min，37℃振荡培养。

2.2细胞生长曲线的测定

取液体培养菌种，以10%接种量接入装50ml液体培养基的150ml三角瓶中120r/min，37℃振荡培养，每间隔1.5h取样，利用紫外分光光度计于560nm测OD值。

2.3原生质体制备与再生

2.3.1 酶解前菌落计数

收集对数生长期的细胞菌液，取1mL，用9mL无菌水稀释至10 ^–1、10 ^–2 、10 ^–3、10 ^–4 、10^–5、10 ^-6 ，取10^–5、10 ^-6 各0.1ml涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，于37℃，倒置培养24h，计菌落数（A）。

2.3.2 原生质体制备

收集对数生长期的细胞菌液，取8mL于灭菌好的离心管中，4000r/ min离心10min，用原生质体制备液（PBS）洗涤1次，收集菌体，加入3ml酶液，保温一段时间，随时观察原生质体形成情况，当90%左右的细胞转化为原生质体时，4000r/min离心10—15min，用PBS洗涤2次，即制得原生质体悬液^[5]。

2.3.3 原生质体再生

取原生质体悬液1ml，用9ml PBS液，稀释至10 ^–1、10 ^–2 、10 ^–3、10 ^–4 、10^–5、10 ^-6，取10^–5、10 ^-6各0.1ml涂布于再生培养基上，37℃培养24h，计菌落数，即得酶解后再生菌落数（C）。取原生质体悬液1mL，用9mL无菌水稀释至10 ^–1、10 ^–2 、10 ^–3、10 ^–4 、10^–5、10 ^-6，取10^–5、10 ^-6各0.1ml涂布于牛肉膏蛋白胨固体培养基，37℃培养24h，计菌落数，即得未形成原生质体菌落数（B）。原生质体形成率（%）=（A-B）/ A *100%；原生质体再生率(%)=(C-B)/(A-B) *100%

2.4影响原生质体制备和再生因素的确定

2.4.1细胞生长期的选择

分别选取菌种液体培养的三个不同时间（6h、8h、10h），按照2.3所述的原生质体制备与再生方法，即酶解前菌落计数、原生质体制备、原生质体再生三步骤，分别记数，其中酶液浓度、温度、时间、再生培养基及再生培养方式分别为：5mg/ml、35℃、45min、添加0.53M 蔗糖和单层培养。根据数据，比较三个不同时间的原生质体形成率和再生率，以此确定最佳细胞生长期（菌龄）。

2.4.2最佳酶液浓度的确定

酶液浓度分别为1mg/ml、5 mg/ml 、10 mg/ml，选取2.4.1确定的最佳菌龄，温度、时间、再生培养基及再生培养方式分别为：35℃、45min、添加0.53M 蔗糖和单层培养，按2.3方法操作。

2.4.3最佳酶解温度确定

收集处于最佳细胞生长期（菌龄）的菌体，酶解温度分别为30℃、35℃、40℃，按2.3方法操作。其中，最佳酶液浓度为2.4.2确定的浓度，时间、再生培养基及再生培养方式分别为：45min、添加0.53M 蔗糖和单层培养。

2.4.4最佳酶解时间的确定

收集处于最佳细胞生长期（菌龄）的菌体，酶解时间分别为30min、40min、60min，以最佳酶解浓度和温度为操作条件，按2.3方法操作。其中，再生培养基及再生培养方式分别为添加0.53M 蔗糖和单层培养。

2.4.5最佳再生培养基的确定

收集处于最佳细胞生长期（菌龄）的菌体，再生培养基分别为添加0.7M KCl 、0.53M 蔗糖、0.75M甘露醇，以最佳酶解浓度、温度、时间为操作条件，按2.3方法操作。其中，再生培养方式为单层培养。

2.4.6最佳再生培养方式的确定

收集处于最佳细胞生长期（菌龄）的菌体，再生培养方式为单层平板和双层平板培养，以最佳酶解浓度、温度、时间、再生培养基为操作条件，按2.3方法操作。其中，再生培养方式中的双层平板法是指在培养皿中倒一层固体再生

培养基，冷凝后，将制备的原生质体用渗透压稳定剂适当稀释，将原生质体悬液与预热的半固体再生培养基混匀，倾注于固体培养基底层平版上培养。将原生质体悬液经无菌水稀释，倒于双层平板作为对照^[9]。

3.结果与分析

3．1 细胞生长曲线测定结果

从图1可以看出产纤维素酶细菌细胞培养3h后即进入对数生长期，培养10h后进入生长平衡期， 14h后，细胞生长进入衰亡期。

图1；JJQ—3的对数生长曲线

Fig1：The logarithms growth curve of  JJQ1—3

3．2 细胞生长期的选择

由图1 JJQ1—3的对数生长曲线可知，培养3—10h期间细胞处于对数生长期，选择培养6h、8h、10h的细胞进行研究。根据实验结果可知，当原生质体形成率分别为92.11% 、98.23%、 95.07%，三种培养时间对应的原生质体再生率分别为16.8%、 23.3% 、20.1%。因此采用对数生长中期（8h）的细胞来制备高活性的原生质体是最佳的。

原生质体形成率和细胞所处的不同生长期有密切的关系。处于不同生长时期的菌体，对各种溶菌酶的敏感性不同，原生质体的制备率不同，而且原生质体的活性差异也很大。大多数研究表明，处于对数生长早期的细胞，幼龄细胞不断生长，代谢活动旺盛，细胞壁对酶的处理最为敏感，在同等条件下原生质体形成率较高，但由于对数生长早期的细胞相对教为脆弱，酶的过度作用会影响原生质体的再生。从指数期到静止期的转折期见，细胞对酶的抗性迅速增加，衰老期的细胞由于代谢水平与活力下降，对酶的反应迟钝，难以原生质体化与再生^[7]。实验结果表明对数生长中期（8h）的细胞能制备高活性的原生质体，而且再生率也相对较高，其原生质体形成率和再生率分别为：98.23%和23.3% 。

图2：生长时间对原生质体形成率和再生率的影响

Fig2：Effect of culture age on the production and reformation rate of protoplast

3．3 溶菌酶浓度

由图3可以看出，最佳溶菌酶浓度为5mg/ml，亲株JJQ1—3的原生质体形成率为98.15%，原生质体再生率为25.6% 。

不同微生物在制备原生质体时所需酶和种类不同，而且所需酶量也存在差异。适宜的酶浓度是影响原生质体制备的重要因素，酶浓度过大时，酶中往往含有对原生质体有害的酶类（如过氧化物酶、核糖核酸酶等），随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时，必然会影响原生质体的活性；酶浓度过大，易使菌体凝集，难于原生质体化；而且，细胞脱壁太彻底，必然降低原生质体的再生率^[3]。实验中采用三种不同浓度的溶菌酶，分别为1mg/ml、5 mg/ml 、10 mg/ml，从实验结果来看，原生质体形成率分别为：94.5%、98.15%、95.85%，其对应的再生率为15.03%、25.60%、18.14% 。

图3：溶菌酶浓度与原生质体形成和再生的关系

Fig3：Effect of Enzyme concentration on the production and reformation rate of protoplast

3．4 酶解时间

由图4可以看出，最佳酶解时间为45min，亲株JJQ1—3的原生质体形成率为98.08%，原生质体再生率为25.49% 。

酶解时间在原生质体制备过程中也是一个非常重要的因素。作用时间过短，镜检时可发现相当多数的细胞尚未完全原生质体化，形成率不高；酶解时间延长，可以提高其完全原生质体化，然而继续延长酶解时间，则导致再生率的降低^[3]。从实验的酶解温度来看，酶解45min时的原生质体形成率为98.08%，此时的再生率为25.49% 。

图4：酶解时间对原生质体形成率和再生率的影响

Fig4：Effect of Enzyme digestion time on the production and reformation rate of protoplast

3．5 酶解温度

从图5可以看出，最佳酶解温度为35℃，亲株JJQ1—3的原生质体形成率为98.08%，原生质体再生率为22.35% 。

酶解温度也可以直接影响到原生质体化程度。一般来说，最适酶解温度都要高于微生物的最适生长温度。在低于最适酶解温度时，随着温度的升高，原生质体制备率不断提高，高于最适酶解温度，原生质体的产量明显减少^[7]。实验中采用的三种不同的酶解温度（30℃、35℃、40℃），结果表明，在35℃酶解时，其原生质体制备率和再生率都是最高的。当然不同的微生物的最适酶解温度也是不同的，人们多采用35℃—37℃或者42℃，真菌的最适酶解温度为30℃—35℃，放线菌的最适酶解温度为28℃—37℃。

图5：酶解温度对原生质体形成率和再生率的影响

Fig5：Effect of Enzyme digestion temperature on the production and reformation rate of protoplast

3.6再生培养基

从图6可以看出，最佳再生培养基为添加0.53M 蔗糖，亲株JJQ1—3的原生质体形成率为98.00%，原生质体再生率为23.86% 。

在微生物原生质体技术中，原生质体再生出细胞壁来，进而在普通的培养基上生长繁殖是一个十分关键的环节，不同微生物的原生质体最适再生条件存在着一定的差异。再生培养基是原生质体进行再生的最重要的外界因素之一，再生培养基一般来说就是在菌体正常生长的培养基中，补充两类物质，一类是营养因子，另一类是渗透压稳定剂。细菌的再生培养基中常补加水解酪蛋白、血清血蛋白、氨基酸和琥珀酸钠等作为营养因子，这些物质可能是作为细胞壁合成的前提物质，也可能通过代谢转化成细胞壁的前体物质或起到促进代谢，加速细胞壁合成的作用。用于再生培养基中的渗透压稳定剂有KCl、NaCl、CaCl₂和MgCl₂等无机离子物质和蔗糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和琥珀酸钠等有机物质^[3、7]。在分别内含0.7M KCl 、0.53M 蔗糖、0.75M甘露醇的三种再生培养基上，原生质体再生能力并不相同。以内含蔗糖的培养基为最佳，甘露醇次之。对比前两种碳水化合物，KCl作为高渗稳定剂的效果最差，不但原生质体制备率低，而且再生率也低。

图6: 再生培养基对原生质体形成率和再生率的影响

Fig6：Effect of the culture of regeneration on the production and reformation rate of protoplast

3．7再生培养方式

从图7可以看出，最佳再生培养方式为双层培养，亲株JJQ1—3的原生质体形成率为98.15%，原生质体再生率为30.25% 。

原生质体再生可以通过固体培养和液体培养两种方式完成。相关研究表明，同液体培养法相比，固体培养法明显有利于原生质体