α-半乳糖苷酶基因Mel1在毕赤酵母中的组成型表达
2006-09-17 17:11:07   来源：不详   评论：0 点击：

   α－半乳糖苷酶（α－galactosidase，α－Gal，EC3.2.1.22）属于外切糖苷酶类，广泛存在于人、动物、植物、真菌乃至原核生物体内的一类水解酶（Bozenaetal.，2004），对α－D-半乳糖苷键有高度专一性，可作用于多种天然及人工合成的底物，反应结果是将底物上的α－D－gal残基末端水解。α－半乳糖苷酶在饲料工业和制糖工业（张树政，1998），血型改造（Melis－saetal.，1996），基因表达检测（PostandLuebke，2005）等方面有广泛的应用。特别在饲料工业上，α－半乳糖苷酶作为添加剂加入到豆粕饲料中能催化α－半乳糖苷类寡糖如棉子糖、水苏糖等动物难以消化的碳水化合物的水解（丁贤等，2001）。目前我国α－半乳糖苷酶的商品化生产少且其价格昂贵，开发高酶活、廉价的α－半乳糖苷酶作为饲料添加剂极富经济价值。
   α－半乳糖苷酶是一种糖基化酶，α－半乳糖苷酶的多肽链上有9个左右的糖基化位点（PirkkoandLiljestrom，1985），正确的糖基化对维持α－半乳糖苷酶的活性与稳定性及其对α－半乳糖苷特异底物的亲和性具有非常重要的作用。因此在大肠杆菌中表达该酶蛋白难以获得稳定的高活性酶产物。本研究选择能进行正常糖基化的毕赤酵母为宿主菌，以丧失了表达内源GAL4转录激活因子能力的酵母AH109为基因来源。从酵母AH109中分离克隆α－半乳糖苷酶的编码基因Mel1，利用质粒pGAPZαA中的组成型启动子pGAP构建pGAPZα－Mel1表达载体，并转化毕赤酵母KM71，获得α－半乳糖苷酶在新的酵母细胞系中的表达。
1材料和方法
1.1材料与试剂
1.1.1菌株及质粒
    大肠杆菌（Escherichiacoli）JM109、毕赤酵母（Pichiapastoris）KM71和质粒pGAPZαA购自INVITROGEN（Carlsbad，California，USA）公司，酵母（Saccharomycesserevisiae）AH109购自CLONTECH（MountainView，California，USA）公司。
1.1.2培养基
    LB、YPD和YPDS培养基参考Adamsetal.（1998）配制方法。
1.1.3主要试剂
    TaqDNA聚合酶及PCR相关试剂购自北京鼎国生物技术公司。PCR产物克隆载体pMD18－T购自宝生物公司。X－α－gal购自CLON－TECH公司（MountainView，California，USA）。1kbDNALadder购自MBI公司（FERMENTASINTER－NATIONALINC.，Burlington，Canada）
1.2方法
1.2.1酵母基因组DNA的提取
    用玻璃珠制备法（Adamsetal.，1998）提取酵母AH109的基因组DNA，对基因组DNA进行紫外检测，并以1kbDNALadder为对照进行琼脂糖凝胶电泳分析。
1.2.2质粒pGAPZαA的制备
    将质粒pGAPZαA转化至E.coliJM109，按Sambrooketal.（1992）的方法提取质粒并用限制性内切酶XhoⅠ和SacⅡ酶切备用。
1.2.3PCR引物设计
    根据GenBank已知的Mel1序列（登录号：X03102）的CDS设计1对引物。

  
    PCR引物由上海生工生物工程技术公司合成。
1.2.4Mel1基因的扩增及T－A克隆
    以酵母AH109基因组DNA为模板，用设计好的引物，按如下条件进行双温PCR反应：94℃，4min；94℃，1min→56℃，50s→72℃，1.5min，共30个循环；72℃延伸15min。PCR反应结束后，以1kb DNA Ladder为对照，取10μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。用PCR产物纯化试剂盒纯化扩增得到的Mel1基因，用PCR产物克隆试剂盒克隆Mel1基因到pMD18－T载体（Amp"），转化感受态E.coliJM109，进行蓝白斑筛选得到阳性克隆。
1.2.5重组质粒pGAPZα－Mal1的构建及筛选
    用限制性内切酶XhoⅠ和SacⅡ对纯化的MEl1基因作完全酶切，完全酶切的pGAPZα与MEl1基因进行连接反应。将连接产物转化感受态E.coliJM109，通过蓝白斑筛选及酶切分析得到阳性克隆pGAPZα－Mel1，经测序分析克隆位点及ORF正确。
1.2.6重组质粒pGAPZα－Mel1转化宿主酵母KM71及鉴定
    重组质粒构建的模式图见图1，将MEl1基因按开放阅读框要求克隆到α－factor信号肽的下游，与GAP启动子一起构建成组成型表达α－半乳糖苷酶得重组载体pGAPZα－Mel1。用质粒提取试剂盒提取重组质粒pGAPZα－Mel1，并用限制性内切酶PagⅠ将其线性化。从YPD平板上挑取KM71单菌落做液体培养，用电击转化法（Adamsetal.，1998）线性化重组质粒pGAPZα－Mel1转化感受态酵母，将转化后的酵母涂布在含有zeocin（100mg／mL）和X－α－gal的YPDS平板上，30℃培养至菌落形成。

     
1.2.7α－半乳糖苷酶的表达分析
    挑取蓝色菌落pGAPZα－Mel1／KM71做摇瓶培养，培养4d后，取发酵液上清10μL做SDS－PAGE（Sambrooketal.，1992）。200V电泳2h后考马斯亮蓝染色，观察蛋白质带。
1.2.8α－半乳糖苷酶的检测
    采用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法，检测表达的α－半乳糖苷酶。酵母培养液8000r／min离心5min，取150μL上清液与100μL2.5×上样缓冲液（3.1mLTris－HCl0.5mol／L，2.5mL99％甘油，0.25mL1％溴酚蓝，4.15mL蒸馏水）混合。10％PAGE，Tris－glycine缓冲液（pH7.5）冰浴75V电泳5h。电泳完毕后，将凝胶沿垂直方向切割成条状，置入10μg／mL的X－α－gal的0.05mol／L醋酸-醋酸钠缓冲液（pH5.5）于30℃温育5h。
    另取0.5mL上清加入6μL X-α-gal（25mg／mL）作酶活性直接显色检测。
1.2.9制作标准曲线及α－半乳糖苷酶的酶活测定
    准确称取1.3911g对硝基酚（C6H5NO3）溶于0.2mol／L NaCO3中，配成1-7μmol／L共7个浓度，在405nm处测定吸收值，制作标准曲线（Shibuyaetal.，1998；Brumeretal.，1999）；每个浓度的标准样品做3个重复，取OD405的平均值，制标准曲线。取发酵液上清10μL，以对硝基苯基-α－D-半乳糖苷为底物测定α-半乳糖苷酶的酶活。
2结果
2.1酵母基因组DNA的提取
    用玻璃珠制备法得到的酵母基因组DNA一般大于20kb，经紫外检测及1％琼脂糖凝胶电泳分析，DNA分子带型整齐（图2）。

    
2.2质粒pGAPZαA的制备
    提取质粒pGAPZαA后作酶切分析，其大小与预期的一致（图3），约3.1kb。

    
2.3Mel1基因的克隆
    以酵母AH109基因组DNA为模板，用设计好的引物进行PCR扩增，特异性扩增得到了约1.4kb的Mel1基因（图4），并将其克隆到了pMD18－T载体中（图5），图5中约2.7kb带为载体pMD18－T，1.4kb的酶切产物为目的基因Mel1。

    
2.4重组质粒pGAPZα－Mel1的构建及筛选
    基因Mel1和质粒pGAPZαA通过酶切、连接和转化，用酶切分析重组子筛选到到阳性克隆pGAPZα－Mel1（图6），图6中4.5kb的条带为未完全酶切的阳性克隆pGAPZα－Mel1，3.1kb的条带为完全双酶切后的载体，1.4kb的条带为目的基因Mel1。

    
2.5重组质粒pGAPZα－Mel1转化酵母
    将重组质粒pGAPZα－Mel1转化酵母培养2d后，转化平板有蓝色菌落出现（图7），而对照平板无菌落生长，获得了α-半乳糖苷酶在新的酵母细胞系中的表达。

   
2.6α-半乳糖苷酶的表达分析
    取重组菌的发酵上清做SDS－PAGE分析，发现在53kD处有特异带（图8）；用发酵液上清做显色反应12h内上清变蓝（图9）；非变性胶电泳后，凝胶与显色底物反应，有一条明显显蓝色的酶带，证实α－半乳糖苷酶的表达（图10）。发酵6d后，取发酵液上清粗酶液10μL与0.5mLPNPG（50mmol／L）反应10min，最后用4.49mLNaCO3终止反应，测得OD405＝0.023，初步分析α-半乳糖苷酶酶学活性为12U／mL。

           
3讨论
    本实验从改变α-半乳糖苷酶Mel1基因转录机理的思路出发，从酵母AH109中分离α-半乳糖苷酶Mel1基因（此基因无内含子），并将其克隆至质粒pGAPZαA中，质粒pGAPZαA中的三磷酸甘油醛脱氢酶启动子是一强组成型启动子，其下游基因的表达不需要有毒物质-甲醇的诱导，为此酶将来在饲料中的安全应用奠定了基础；通过酿酒酵母与毕赤酵母的密码子偏好性分析，发现两者使用的偏好密码子基本一致，这为Mel1基因能在毕赤酵母进行转录后的正常蛋白翻译提供了分子基础；质粒pGAPZαA是一种整合型载体，线性化后可通过三磷酸甘油醛脱氢酶启动子的同源重组高效整合到毕赤酵母的基因组中，保证了目的基因的稳定表达；质粒pGAPZαA中α－factor信号肽使表达产物分泌至胞外，方便了产物的检测和纯化。本研究构建成重组质粒pGAPZα－Mel1后，经测序分析，基因插入位点正确，并且保证了ORF的完整。将线性化的重组质粒pGAPZα－Mel1转化毕赤酵母KM71，在含有抗生素zeocin和预先涂布有X－α－gal的YPDS平板上选择到蓝色菌落，实现了α-半乳糖苷酶在酵母内的组成型表达。经SDS－PAGE分析，在53kD处有特异分子带，符合预期分子大小，但在53kD处有2条分子带，这可能是糖基化程度不一致造成的。重组菌株pGAPZα－Mel1／KM71摇瓶发酵6d后粗酶活约12U／mL，此酶活较低，还没达到工业化生产的要求，深入的发酵条件摸索、酶动力学研究及Mel1基因的改造和定点突变尚在后续的研究中。