酵母菌产甘油激酶的发酵条件优化
2006-09-17 17:11:11   来源：不详   评论：0 点击：

 血清中甘油三酯的含量是临床上诊断心血管系统疾病的重要指标之一，而酶法测定甘油三酯以其高专一性、灵敏、快速等优点已逐渐取代传统的化学检测法。 甘油激酶(ＧＫ， 2.7.1.30)是甘油三酯试剂盒测   ＥＣ定反应中的关键酶之一，它可以从不同来源的生物组织中提取出来，例如鼠肝、鸽肝、乳酸菌、根霉菌、锥虫[1－4]。目前，国内外主要是从大肠杆菌[5]和嗜热脂肪芽孢杆菌[6]中发酵生产。
 实验从大量菌种中筛选到1株产ＧＫ活力较高的德巴利酵母菌，目前国内尚没有关于德巴利酵母产甘油激酶的报道。本文探讨了该菌株的发酵条件。
1 材料与方法
1.1 菌种与培养基
1.1.1 菌种
 德巴利酵母(Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ ｓｐ.)：由本实验室选育得到；其余菌种由本校微生物实验室提供。
1.1.2 培养基
 斜面培养基：葡萄糖1％，蛋白胨2％，酵母浸膏0.5％，琼脂粉2％。
 种子培养基：不加琼脂，其它同斜面培养基。
 发酵培养基：葡萄糖0.1％，ＫＣｌ 0.18％，酵母膏0.25％，乙酸钠0.82％，甘油1％。
 优化培养基：葡萄糖0.1％， 0.18％，酵母膏0.3％，ＫＣｌ柠檬酸0.6％，甘油0.5％。
1.2 培养方法
 德巴利酵母在斜面上28℃培养48ｈ，接入种子培养基(100ｍＬ培养基/250ｍＬ三角瓶)于28℃、200ｒ/ｍｉｎ旋转摇床培养20ｈ，再按10％的接种量接入装有100 ｍＬ发酵培养基的250ｍＬ三角瓶中，相同条件培养24ｈ。
1.3 无细胞粗酶液的提取
 发酵液4000ｒ/ｍｉｎ离心5ｍｉｎ，用生理盐水洗涤菌体2次后将菌体悬浮于20ｍｍｏｌ/Ｌ，ｐＨ8.5的Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ缓冲液中，经高压匀浆[7]，细胞破碎液4℃、12000ｒ/ｍｉｎ冷冻离心10ｍｉｎ，上清液即为无细胞粗酶液。
1.4 蛋白质含量的测定
 采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法[8]。
1.5 酶活力的测定
 Ｗｉｅｌａｎｄ－Ｓｕｙｔｅｒ法[5]。0.2ｍｏｌ/Ｌ甘氨酸－水合肼缓冲液(ｐＨ9.8)3ｍＬ，甘油3ｍｍｏｌ/Ｌ ，ＡＴＰ 1.5ｍｍｏｌ/Ｌ， ＮＡＤ＋0.42ｍｍｏｌ/Ｌ，ＭｇＣｌ23.6ｍｍｏｌ/Ｌ，Ｇ－3－Ｐ 5.4μ/ｍＬ，混合液于25℃保温5ｍｉｎ后加入50μＬ适当稀释的酶液，测定ＯＤ340吸光度变化，在上述条件下，每分钟催化生成1ｍｍｏｌ/ＬＮＡＤＨ所需酶量为一个酶活力单位。
1.6 主要仪器与试剂
 高压匀浆机 (ＡＰＶ Ｇａｕｌｉｎ)，高速冷冻离心机(Ｂｅｃｋｍａｎ Ｊ－25)，紫外分光光度计(北京谱析通用仪器有限责任公司 ＴＵ－1800)，肼水合物、ＡＴＰ、ＮＡＤ＋、Ｇ－3－Ｐ、 (Ｓｉｇｍａ)，其它试剂均为国产分析纯。ＢＳＡ
2 结果与讨论
2.1 产甘油激酶菌种的筛选
 将欲筛选该酶的菌种在斜面培养基上连续传代数次，发酵培养后测定其产酶活力。胞内酶、胞外酶分别在上清液和破细胞粗提液中比较，得到产甘油激酶活力较高的菌株―德巴利酵母(见表1)。

          
2.2 培养基成分对甘油激酶形成的影响
2.2.1 碳源的影响
 以不同的碳源(0.5％)代替发酵培养基中的葡萄糖和乙酸钠来培养菌体。从表2可以看出，柠檬酸加葡萄糖的培养基产酶较高。

            
2.2.2 氮源的影响
 在发酵培养基中加入不同的氮源(0.2％)进行产酶实验，结果见表3。从表3可知，酵母膏的效果最好。

     
2.2.3 甘油含量的影响
  由于甘油激酶是一种诱导酶，在培养基中加入不同浓度的诱导物甘油，发现甘油含量为0.5％时，酶的产量最高(见表4)。

   
2.3 正交试验分析
  以葡萄糖和柠檬酸为碳源，酵母膏为氮源，进行Ｌ9 (3)4正交试验因素水平分析，试验结果和极差分析见表5。 

        
  由表5可知，ｐＨ值对甘油激酶产量的影响最大。最佳的发酵培养基配方是葡萄糖1ｇ/Ｌ，酵母膏3 ｇ/Ｌ，柠檬酸6 ｇ/Ｌ，ＫＣｌ 1.8 ｇ/Ｌ，ｐＨ5。
2.4 培养条件对胆固醇氧化酶产量的影响
2.4.1 培养温度对产酶量的影响
 将菌种接入优化培养基，于不同温度进行培养，结果发现，31 ℃是该菌的最适培养温度，得到较高的酶活力与比活(见图1、图2)。

        
2.4.2 通气量对产酶量的影响
 250ｍＬ的三角瓶中分别装入不同体积的发酵培养基，与不同转速的摇床培养作交叉试验，结果表明，装料量120ｍＬ，160ｒ/ｍｉｎ效果最好(见表6)。

     
2.4.3 接种量对产酶量的影响
 按不同接种量将液体种子接入发酵培养基，试验结果(见表7)，从表7可知，6％接种量最好，4％-10％均可接受。

     
2.4.4 液体种子菌龄对产酶量的影响
 选用不同菌龄的液体种子进行接种，结果表明，用24ｈ菌龄的液体种子进行接种能够得到最高酶活(见表7)。

         
2.4.5 培养时间对产酶量的影响
 在优化培养基及最适条件下发酵培养菌体，不同时间取样测定ＧＫ活力与比活，图2表明，菌体培养25ｈ后酶活最高为1.19 Ｕ/ｍｇ。
3 结论
  从大量菌体中筛选得到产甘油激酶的德巴利酵母菌，并对其发酵条件进行了优化，利用其自然底物—甘油进行发酵诱导，确定其最佳发酵条件为葡萄糖1ｇ/Ｌ，酵母膏3 ｇ/Ｌ，柠檬酸6 ｇ/Ｌ，ＫＣｌ 1.8 ｇ/Ｌ，甘油0.5％，接种量6％，ｐＨ5，液体种子为24ｈ菌龄，装液量为120ｍＬ培养基/250ｍＬ三角瓶，160ｒ/ｍｉｎ于31℃培养25ｈ，此条件下得到的甘油激酶酶活力为1.19 Ｕ/ｍｇ。