β-半乳糖苷酶诱导条件优化的研究
2010-10-23 09:45:29   来源：湖南农业大学 生物科学技术学院 湖南长沙 410128   评论：0 点击：

摘　要：β-半乳糖苷酶是一类非常重要的糖苷水解酶，已被广泛应用于食品工业降低乳制品中的乳糖含量。从市售不同品牌的普通酸奶中分离出8株乳杆菌，分别编号为SN1、SN2、SN3、SN4、SN5、SN6、SN7、SN8。通过镜检、革兰氏染色、过氧化氢酶反应、糖发酵反应等初步鉴定为保加利亚乳杆菌。对其中一株菌产β-半乳糖苷酶的条件进行优化研究，采用乳糖进行不同浓度的诱导，结果表明当乳糖浓度为1.00%时的诱导效果较好；IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)是一种乳糖类似物，也可诱导菌株产生β-半乳糖苷酶，且其终浓度为0.8mM时的诱导效果较好；对两种诱导剂进行诱导效果的比较，表明应用0.8mM的IPTG可达到最佳诱导效果。

关键词：保加利亚乳杆菌  β-半乳糖苷酶  诱导条件  优化

β-半乳糖苷酶(β-galactosidase，EC. 3. 2. 1. 23)又称乳糖酶， 广泛存在于动物、植物和微生物中，它能水解乳糖生成半乳糖和葡萄糖， 在食品工业中有着广泛的应用。1998年被中国食品添加剂标准化委员会列为食品添加剂新品种，用于水解牛乳和其它乳制品中的乳糖，解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题等。乳糖不耐受症是指由于人体肠道中乳糖酶缺乏而引起的对乳糖的吸收不良，进而产生的一系列消化道症状。据统计，全世界70%以上的人口有不同程度的原发或继发性乳糖酶缺乏，我国乳糖酶缺乏者占汉族成人的比例高达75% ~95.7%。

某些种类的β-半乳糖苷酶由于具有构型保持酶作用机制，在水解乳糖分子的同时，还具有转半乳糖基作用，即以乳糖或其水解产物半乳糖和葡萄糖为糖基受体，生成半乳糖苷键，被用于合成生物活性物质即低聚半乳糖。多种微生物如细菌、霉菌、酵母菌能产生β-半乳糖苷酶，其中乳酸菌产生的β-半乳糖苷酶由于来源安全，符合食品级要求而日益受到重视。保加利亚乳杆菌是普通酸奶发酵菌之一。研究发现，乳糖不耐受者能耐受酸奶的原因就是因为其中的保加利亚乳杆菌活菌产生的β-半乳糖苷酶。保加利亚乳杆菌β-半乳糖苷酶是一种胞内酶，其产生受到发酵培养条件的影响，但国内这方面的研究较少。

目前仅有来源于微生物的β-半乳糖苷酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取β-半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地理位置等因素的影响。但不同的诱导条件对微生物来源的β-半乳糖苷酶的水解活性和半乳糖基转移活性产生不同影响。本试验从市售不同品牌的普通酸奶中分离出8株乳杆菌，对其中一株菌产β-半乳糖苷酶的条件进行乳糖诱导条件优化的研究和IPTG诱导条件优化的研究。

1  材料与方法

1.1  材料与设备

1.1.1  菌株来源8种不同品牌的普通市售酸奶。

1.1.2　培养基与培养条件

MRS培养基（pH 6.5），培养条件均为在37℃恒温培养箱中恒温培养。

1.2  操作方法与步骤

1.2.1  酸奶中乳杆菌的分离纯化

在超市购买多种不同品牌的普通酸奶，在无菌的操作条件下，从酸奶样品中吸取适量样品利用MRS液体培养基和MRS固体培养基反复多次培养划线及镜检，直到得到纯培养的菌株。

1.2.2  菌株的初步鉴定

根据细菌分类手册通过菌落的形态观察、细胞形态的观察、革兰氏染色、过氧化氢酶反应、糖发酵反应等初步鉴定所分菌株。

1.2.3  β-半乳糖苷酶粗酶液的制备

(1) 乳酸菌菌液的制备

100ml三角瓶装30ml MRS液体培养基，接种体积分数为1%，震荡摇匀后放入37℃恒温培养箱中培养36h。

(2) β-D-半乳糖苷酶的诱导

在无菌的条件下，称取定量乳糖或IPTG，加入发酵液中作为诱导剂，放入37℃恒温培养箱中继续培养，诱导时间为1h。

2  结果与分析

2.1  乳糖诱导条件的优化

将乳糖定量加入发酵液中，使终浓度分别为0.70%、1.00%、1.30%、1.60%，经1h的诱导后，制取粗酶液测酶活力，结果如图1所示。