α-乙酰乳酸脱羧酶的基因克隆及在大肠杆菌和酿酒酵母中的表达
2007-12-06 14:14:40   来源：本站原创   评论：0 点击：

　摘要：以pUC19质粒为载体，以E. coli JM109为受体，构建了含α-乙酰乳脱羧酶（α-ALDC）基因的地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis AS10106 的基因文库,得到4800个重组转化子中均含有4～10kb的外源插入DNA片段。从基因文库中筛选到6个阳性克隆，对其中1个克隆的α-乙酰乳酸脱羧酶基因片段进行亚克隆分析表明，该α-乙酰乳酸羧酶基因位于1.6kb的BamHⅠ-EcoRⅠ片段上。对其研究发现，α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中表达产生的乙酰乳酸脱羧酶在最适反应温度和pH值等与供体菌的酶活相当。利用大肠杆菌和酵母穿梭质粒pYES2为载体，可以将α-乙酰乳酸脱羧酶基因引入酿酒酵母中，从而使重组酵母菌株具有降解啤酒发酵中生成的α-乙酰乳酸，减少双乙酰含量的能力。

　　中图分类号：Q523　文献标识码：A

　　文章编号：0379-172(2000)02-165-169

α-acetolactate Decarboxylase from B. licheniformis AS10106:

　　Cloning and Expression Gene in E. coli and S. cerevisiae

QIN Yu-Jing, GAO Dong, WANG Zu-Nong

　　(Department of Microbiology, Shandong University, Jinan 250100, China)

　　Abstract:A genomic library of B. licheniformis AS10106 that contained the α-acetolactate decarboxylase gene(α-ALDC) was constructed with vector pUC19 and host E. coli JM109 strain. The inserted fragments of foreign DNA ranged from 4 to 10kb in the 4800 clones thus obtained. Six positive clones were detected after screening the plated library by the method of clony coloration. Subcloning of the DNA fragment containing the α-acetolactate decarboxylase gene showed that the α-acetolactate decarboxylase gene was on an 1.6kb BanHI-EcoR I fragment. Preliminary analysis of the enzyme expressed from one recombinant plasmid pGEA showed that the properties of the recombinant enzyme, such as the optimal temperature and pHof reaction, were identical to those of the native enzyme. Using yeast-E. coli shuttle vector pYES2, an exprssion recombinant plasmid pYEA containing B. licheniformis AS10106 α-acetolactate decarboxylase gene was constructed. S. cerevisiae H158 transformed with pYEA had expressed α-acetolactate decarboxylase activity and shown the ability to reduce the formation of diacety1 during beer fermentation.

　　Key words：α-acetolactate decarboxylase; gene cloning; expression

　　α-乙酰乳酸是啤酒发酵母细胞体内缬氨酸生物合成的中间产物,也是使啤酒产生异味(馊酸味)的双乙酰的前体物,α-乙酰乳酸脱羧酶能催化α-乙酸乳酸脱羧生成乙偶姻而不经双乙酰形成途径.由于双乙酰是影响啤酒口味及熟化期长短的关键（阈值≤0.1mg/L）Godtfredsen等人^[1]发现α-乙酰乳酸脱羧酶存在于许多种细菌中，但在酵母菌中不存在，因此，如果能将外源的α-乙酰乳酸脱羧酶降解啤酒发成的α-乙酸乳脱羧苈在引入酿酒酒酵母中并使其表达，利用产生的α-乙酰乳酸脱羧酶降酶降解啤酒发酵生成的α-乙酰乳酸，将能减少双乙酰带来的异味，缩短啤酒熟化期，降低生产成本。国外已有多个来自不同细菌的α-乙酰乳酸脱羧酶基因被克隆^[2～4]，有的基因片段已经整合到酵素养细胞内^[5]。本文报道了在地衣芽孢杆菌中进行的α-乙酰乳酸脱羧酶基因克隆，并成功地将α-乙酰乳酸脱羧酶基因导入大肠杆菌和酿酒酵母中。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和质粒　 产α乙酰乳酸脱羧酶的地衣芽孢杆菌B. licheniformis AS10106，

　　大肠杆菌E. coli JM109(thiD(lac-ProAB)F’［traD36 lacⅠq lacZDM15］ supE44)和酿酒酵母S. cerevisiaeH158(leu2-3 leu2-112 ura3-52 trp1-289 his4-519 prb1 cir^＋)，以及质粒pUC19、pGEM-3Zf（-）、PYES2均由本实验室保存。

　　1.1.2 培养基　LB培养基： 1%蛋白胨，0.5%酵母粉，1% NaCl。YT培养基： 0.8%蛋白胨，0.25%酵母粉，0.25%NaCl。鉴别培养基^［6］：1%葡萄糖，0.5%蛋白胨，0.25%酵母粉，0.5% NaCl。YEPD培养基：2%葡萄糖，2%蛋白胨，1%酵母粉。SG培养基：0.6%Yeast Nitrogen Base, 2%半乳糖，补加所需各种氨基酸。

　　1.1.3 酶及生化试剂　各类限制性内切酶、T4 DNA连接酶和碱性磷酸酯酶购自Promega公司。 SDS，溶菌酶购自华美生物工程公司。酶活检测用底物前体2-乙酰氧基-2-甲基-乙酰乙酸乙酯（ethyl-2-acetoxy-2-methyl-acetoacetate）购自Aldrich公司。肌酸、α-萘酚和邻苯二胺为上海化学试剂总厂产品.

　　1.2 方法

　　1.2.1 DNA操作　染色体DNA的抽提方法根据文献［7］。质粒DNA的抽提，纯化，酶切和连接及大肠杆菌转化均按文献［8］进行。酵母菌完整细胞转化按文献［9］。

　　1.2.2 阳性克隆的筛选^［6］　在培养好细菌菌落的鉴别培养基平板上倾注一层检测琼脂（2ml 0.5%肌酸，2ml 5%α-萘酚,8ml 5%琼脂），室温放置30min后，观察颜色反应，菌落呈红色者为阳性克隆。

　　1.2.3 α-乙酸乳酸脱羧酶酶活测定　　按Loken等^［10］的方法进行。α-乙酰乳酸脱羧酶的一个酶活单位定义为:PH 6.0，37℃条件下，每小时产生1μmol／L乙偶姻所需要的酶量。

　　1.2.4 双乙酰含量测定^［11］　100ml啤酒发酵液加入预热的双乙酰蒸馏器中，加热至馏出液25ml，取10ml加入0.5ml 1%邻苯二胺，摇匀置暗处30min，加入2ml 4mol／L HCl，混匀后335nm测其光吸收。

　　1.2.5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳AGE）　采用Laemmli不连续缓冲系统^［12］。浓缩胶浓度5%，分离胶浓度12%。

　　2 结果与讨论

　　2.1 B. licheniformis AS10106菌株α-乙酰乳酸脱羧酶基因的克隆。

　　B. licheniformis AS10106染色体DNA用BamHⅠ部分酶切，回收大于4kb的片段，pUC19质粒用BamHⅠ完全酶切，碱性磷酸酯酶处理后和回收的染色体DNA片段连接，转化E. coli JM109，在含氨苄青霉素的麦康凯平板上挑选白色重组子，共得到含有4～10kb插入外源DNA片段的4800个重组子，并从重组子中筛选得到6个阳性克隆，其中1个克隆所含质粒pALE的插入片段最小，为6.6kb。

　　2.2 α-乙酰乳酸脱羧酶基因片段的定位

　　为了确定α-乙酰乳酸脱羧酶基因的位置，利用限制性内切酶对PALE质粒中的插入片段进行单酶切和双酶切分析，以质粒pUC19 Polylink的酶切位点为参考，得到了其物理图谱。将不同酶切片段与载体质粒pGEM-3Zf（-）连接，获得多个含α-乙酰乳酸脱羧酶基因不同区域的亚克隆重组质粒，通过酶活测定，将α-乙酰乳酸脱羧酶基因定位于1.6kb的BamHⅠ-EcoRⅠ片段上，该重组质粒命名为pGEA。为了验证克隆基因片段的正确性，将插入片段与B. licheniformis AS10106染色体进行分子杂交，结果表明重组质粒中的外源插入DNA片段确实来源于B. licheniformis AS10106基因组。

　　2.3 重组α-乙酰乳酸脱羧酶基因在大肠杆菌中的表达和生物学性质

　　重组质粒pGEA转化E. coli JM109，挑取单菌落接种含氨苄青霉素的2YT培养基，37℃培养过夜作为种子液，转接新鲜2YT培养液（含氨苄青霉素），振荡培养到OD₆₀₀至1.0，加入0.1mmol／L IPTG诱导6h后，离心收集菌体，取重组转化菌株的提取液进行α-乙酰乳酸脱羧酶酶活分析，结果表明，其最适反应温度和PH等均与从B. licheniformis AS10106中提取得到的天然酶的性质相似（图1）。

 

图1　天然和重组α-乙酰乳酸脱羧酶的最适作用比较

　　Fig.1 Comparison for the temperature of the native and recombinat α-acetolactate decarboxylase A.pH;B temperature ;a.Native α-ALDC;b.Recombinant α-ALDC

　　SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳显示，Ecoli JM109／pGEA在IPTG诱导后产生一条明显的分子量为34kDa的蛋白质表达条带（图2）。

 

图2　质粒PGEA表达产物的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析

　　Fig.2 SDS-PAGE analysis of the expression product of plasmid pgea a.Molecular weight marker b.Proteins fo E.coli JM109/PGEA no induced by IPTG ;c.Proteins of E.coli JM109 PGEA induced by IPTG

　　2.4　α-乙酰乳酸脱羧酶基因在酿酒酵母中的克隆及表达

　　α-乙酰乳酸脱羧酶由于在啤酒发酵中可以使发酵液中的α-乙酰乳酸直接脱羧为乙偶姻，而S. cerevisiae本身不含α-乙酰乳酸脱羧酶基因，如果能将外源α-乙酰乳酸脱羧酶基因引入S. cereviside，则可以达到加速啤酒成熟，缩短啤酒发酵周期的目的。pYES2质粒为E. coli和S. cerevisiae的穿梭质粒，含有的GAL1强启动子能使原核生物基因在S. cerevisiae中表达^［13］，将pGEA重组质粒中1.6kb的α-乙酰乳酸脱羧酶基因片段用BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，回收DNA片段，与pYES2质粒连接（图3），得到重组质粒pYEA，将该质粒转化S. cerevisiae H158，得到酵母重组转化子。

 

图3　重组质粒PYEA的构建

　　Fig.3Construction of recombinant plasmid PYEA

　　检测α-乙酰乳酸脱羧酶基因在S. cerevisiae H158中的表达产物酶活分析表明，α-乙酰乳酸脱羧酶的产生随菌体生长而变化。重组菌株在转接后8h已有一定量的重组α-乙酰乳酸脱羧酶产生，表明酶的生成是在酵母生长对数期，且随培养时间的增长和菌体的生长，酶活不断升高，36h达最高值。利用含质粒pYEA的酿酒酵母重组工程菌株，对啤酒发酵液中双乙酰含量的作用进行了初步研究，结果显示（图4），含有α-乙酰乳酸脱羧酶基因的重组工程菌株在进行啤酒发酵6天后，就可以将发酵液中双乙酰的含量降低到口味阈值以下，比对照的一般菌株的发酵，能将啤酒的熟化时间缩短一半以上。

 

图4　洒发酵中双乙酰含量变化曲线

　　Fig.4 Formation and reduction of diacetyl during beer fermentationa.H158(pyea);b.H158

　　参考文献

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