酵母富硒工艺优化研究
2007-12-18 22:37:40   来源：食品与发酵工业   评论：0 点击：

关键词：酿酒酵母；富硒；优化研究 

硒是人体生命中不可缺少的微量元素之一，在人体内总含量为14~20毫克，广泛分部于所有组织器官中，浓度高者有肝、胰、心、脾、牙及指甲，而脂肪组织中浓度最低，它对人体的正常代谢起着重要的调节作用，因而被喻为“生命火种”、“抗癌之星”。

同时硒是一种稀散元素，不同地区食物中的硒含量不同，这与地理环境中的硒含量有关，在世界27个国家及美国几十个洲的流行病理学调查研究结果表明：土壤、食品、水中的含硒水平越低，癌症及心脑血管疾病的发病率及死亡率越高。硒是构成谷胱甘肽过氧化物酶的成份，参于辅酶A和辅酶Q的合成，是良好的营养调节剂、抗氧化剂、对抗金属的解毒剂，缺“硒”将会导致40多种疾病的发病率增高。然而自然界的“硒”在地壳中的含量极低，且与其它元素共生，人体难以吸收，全世界共有40多个国家缺硒，我国缺硒省份高达22个。

目前国内外盛行用无机硒作为补硒制品，如亚硒酸钠片剂。但是无机硒与有机硒相比，有生物活性低而毒副作用大，且不易吸收等问题。针对我国缺硒现象是普遍存在的这一现状，如能通过每天摄入一定量的富硒食品即能达到理想的补硒效果，从而实现强身健体、延长寿命的作用己成为目前功能性食品研究的迫切课题之一。在研究众多的富硒制剂和食品添加剂中，酵母经富硒培养后得到的富硒酵母，因其自溶物中有机硒含量高，同时还含有丰富的氨基酸、核苷酸、多肽、蛋白质和一些微量元素与维生素，可作为良好的富硒食品的添加剂而倍受重视。而如何获得含硒量高的酵母是一个重要的前提，本文研究了酿酒酵母1605富硒工艺的优化。

１  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  菌种  酿酒酵母1605。

1.1.2  培养基

（1）YEPD培养基　葡萄糖２％，蛋白胨２％，酵母膏１％，自然PH值，固体加２%琼脂、121℃灭菌15分钟。

（2）麦芽汁培养基　自制麦芽汁10º （采用分段糖化法，将麦芽粉:水＝1:3混匀，先在54℃糖化１h，再升温到65℃糖化30~40分钟，再在72℃糖化40分钟，煮沸过渡，调糖度至10º ），pH=6.0。

（3）加入的硒均单独灭菌。

1.1.3  试剂

0.2mol/L  EDTA-2Na；5% NaOH；0.5% ３、３′-二氨基联苯胺；甲苯；1:1HCl；1μg/ml 硒标准溶液等。

1.1.4  仪器

     722S分光光度计；LRH－150B 生化培养箱；SW-CJ-1F超净工作台；DSX－280A不锈钢手提式消毒器；TGL-16G高速台式离心机；101-2型干燥箱等。

1.2  方法

        菌种活化→驯化

↓

培养基配制→发酵培养→发酵液分离→清洗→新鲜硒酵母→干燥(100℃，5h)→富硒酵母                                                       ↓

取上清液→硒含量测定→计算酵母硒含量及有机硒转化率

1.2.1  菌种活化、驯化

    将少量固体原种接入YEPD液体培养基中，在28℃培养25小时，后再转接入加有适量硒的YEPD液体中进行驯化培养。

1.2.2  富硒工艺优化

    首先通过预备试验确定因素和水平，然后通过正交试验确定其最优化工艺条件。

1.2.3  酵母产量的测定

 将待分离发酵液用高速离心机4000rpm离心20分钟，分成两部分，上清液取出备后续测定使用，下层酵母沉淀用无菌水清洗两遍，得新鲜湿酵母。将湿酵母置100℃的烘箱内干燥至恒重。

1.2.4  酵母中硒含量的测定及富硒能力(有机硒转化率)计算-3，3′-二氨基联苯胺比色法

1.2.4.1  测定原理

在PH２~３条件下，硒与3、3′－二氨基联苯胺（DAB）反应形成稳定的Se-DAB络合物，显色反应在30分钟内完成。在PH6左右时，通过甲苯萃取，在该体系中络合物最大吸收波长为420nm。可通过分光光度计测定其吸光度，先绘制出标准硒曲线，然后再测出样品吸光度，可从该标准曲线上查出对应的硒含量。

1.2.4.2硒标准溶液

    准确称取0.1000g硒，置于50ml小烧杯中，力入1:1盐酸10ml,加热溶解，冷却并转移至100ml容罱瓶中，用10％硝酸溶液洗小烧杯合并沈液于容帚瓶中，并用10％硝酸稀释至刻度。此溶液每毫升含1毫克硒，用时可稀释成每毫升含1微克硒。

1.2.4.3标准曲线绘制

准确吸取1μg／ml硒标准液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0ml，分别移入分液漏斗中，加水至35ml。分别加入5％EDTA-2Na溶液1ml，摇匀，用1:1盐酸调节pH2-3左右，各加0.5％3，3′-氨基联苯胺溶液4ml，摇匀，置于暗处30分钟，再用5％氢氧化钠溶液调节至中性，加10ml甲苯振摇2分钟，静置分层，弃去水层，甲苯层通过棉花栓过滤于比色皿中，于420nm波长处测定吸光度，绘制标准曲线(见图1)。

1.2.4.4  残留无机硒含量的测定

    取适量样品，5000rpm高速离心机离心30min，取20ml上清夜，加水至35ml，加入5％EDTA-2Na溶液 1ml，以下同标准曲线。根据样品测得的吸光度，从标准曲线中查得相应的硒含量，此为无机硒含量。

1.2.4.5  有机硒含量的测定

  有机硒含量=总硒含量一残留无机硒含量

２  结果与分析

2.1  正交因素水平确定

2.1.1  培养时间选择

发酵培养时间直接影响酵母生长的几个不同阶段，酵母中的硒含量取决于酵母生长过程中吸收、转化无机硒的量。10%试管种子分别接种到含亚硒酸钠9mg/L、12 mg/L、15 mg/L培养基中，28℃培养，每隔一定时间测定酵母的数量，获得酵母生长曲线（如图2）。

从图2可以看出，培养至25~35h时酵母生长达到稳定期，酵母产量基本接近最高值。因此在后面的正交试验中选取了发酵培养时间为25h、30h、35h三个水平。

2.1.2  硒浓度的选择

酵母对于硒的转化，在一定的浓度下可以将无机硒转化为有机硒。在高浓度硒存在的环境下，酵母虽然仍可以生长，但体内硒过量而转化为单质硒沉积在细胞内，使酵母出现微红色，甚至红色。因此由实验得到在硒浓度为20 mg/L条件下，酵母呈现出微红色，此值可认为是一个临界点，即菌体内无机硒开始积累的标志，因此在正交试验中选取了发酵培养基中硒浓度12 mg/L、16 mg/L、20 mg/L三个水平。

2.1.3  接种量和培养基的选取

在一般的发酵培养中接种量多为10%左右，此处为了研究初始菌量对硒产量的影响，选取了8%、10%、12%三个水平。

而对于不同的培养基条件，在实验中发现其酵母生长量基本一致，即在麦芽汁中和YEPD培养基中的酵母生长情况是一致的，二者没有太大的区别。故在后续实验中选取了YEPD培养基作为实验用培养基。

2.2  富硒工艺优化

酵母富硒工艺的优化，是以酵母中的硒含量及有机硒转化率的高低来衡量的，通过以上分析，影响酵母中硒含量及有机硒转化率的主要因素有以下３个，富硒正交试验各因素水平见表1

表1  富硒正交试验因素水平表

通过正交试验确定酵母发酵培养的最优工艺条件，以上面所取的三个因素，三个水平进行正交试验。试验结果见表2。          

表2  富硒正交试验结果

从表2上比较可经看出，转化率高的最优化组合是A₂B₂C₁，即加硒量为16mg/L、接种量为8%、在28℃培养30h。同时可以从表2看出，三种因素在所选水平范围内，对各项指标的影响是不同的。对硒产量和硒的转化率影响最大的是硒的添加量和培养时间；如果仅从硒产量的角度而言A₃B₃C₁组合产有机硒产量较高，这是因为培养基中的高硒浓度有利于硒的产量提高，但是这样并不经济。通过这种方法虽可以在一定的范围内使有机硒的含量得以提高，但是无机硒的转化率却比较低，致使发酵液中的无机硒残留较高，不利环境保护和资源的有效利用。所以这一组合并不可行。在对培养时间的选取上，当菌量达到一定的浓度后，其有机硒的产量也不会发生太大的变化，所以应该在保证高硒转化率的前提下，尽可能的缩短发酵时间。这是因为当酵母生长平衡期后，要有相当数量的酵母发生自溶，使体内以积累的有机硒释放到培养基质中而造成浪费。从经济合理的角度出发，综合以上几种因素，我们选取了A₂B₃C₁为最优组合。在该条件下，有机硒的产量可达12.39mg/L、无机硒的转化率可达82.62%。

3  结论

3.1  该酵母菌的最优条件组合是：加硒量16 mg/L、接种量8%、在28℃下培养30h。在该条件下，生产富硒酵母时，有机硒的含量和硒的转化率分别可达12.39mg/L和82.62%；

3.2  酵母的富硒能力在20mg/L的浓度下，随浓度的升高而提高其转化率，但在该浓度之上时，这种转化能力开始降低；

3.3  酵母大都具有较强的富硒能力，也可作为富硒酵母生产菌种。

参考文献

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[4]王少为.人体必需微量元素－硒.广东微量元素科学,1999,6(6):50-51.