重组酿酒酵母r-PA 发酵条件的优化
2006-09-17 17:22:30   来源：不详   评论：0 点击：

     组织型纤溶酶原激活剂突变体(r-PA)是新一代安全、有效的溶解血栓药物，在临床上能够替代链激酶、t-PA 等药物用于治疗栓塞性疾病，有着巨大的市场应用前景[1]。目前国内外正在积极寻找适宜的途径来生产 r-PA。酿酒酵母是最早应用于外源基因克隆和表达的宿主菌，随着人们对酿酒酵母的分子生物学研究越来越透彻，对其基因及内部环境也越来越了解，使得酿酒酵母表达系统的应用范围越来越广泛[2]。作者构建了 r-PA 酿酒酵母分泌性表达载体，并导入酿酒酵母中，获得了 r-PA 重组酿酒酵母菌株。本文通过 PCR技术对 r-PA 重组酿酒酵母进行了鉴定，并通过摇瓶分批发酵探讨了该重组酿酒酵母生物合成 r-PA 的适宜发酵条件，为 r-PA 的生产探索了一条新途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
     酿酒酵母（Saccharomyces serevisiae ）INVSsl 及质粒 pYES2 购自 Invitrogen 公司。
1.1.2 培养基
     YPD 培养基用于宿主菌株的保存，其成分为酵母膏 10 g/L，蛋白胨 10 g/L，葡萄糖 20 g/L；pH 6.0。
     SC 基本培养基用于转化菌株的保存及细胞增殖，其成分为 YNB 6.7 g/L，葡萄糖 20 g/L，色氨酸 0.1 g/L，亮氨酸 0.1 g/L，组氨酸 0.1 g/L；pH 6.0。
     SC 诱导培养基用于蛋白的诱导表达，其成分为 YNB 6.7 g/L，半乳糖 20 g/L，色氨酸 0.1 g/L，亮氨酸0.1 g/L，组氨酸 0.1 g/L；pH 6.0。
1.1.3 仪器和试剂
     基因扩增仪：杭州大河热磁电子有限公司（日资）
     TaqDNA 聚合酶为 BBI 公司产品，其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
1.2 方法
1.2.1 重组酵母的鉴定
     随机选取酿酒酵母转化子，提取质粒，采用玻璃株法[3]。以此质粒 DNA 为模版，用 r-PA 基因特异引物进行 PCR 反应，所用引物为：5’-GCT CTC GAG AAA AGA TCT TAC CAA GGA AAC AGT GAC TGC TAC
TTT G 和 5’- ATG TCG ACT TAT CAC GGT CGC ATG TTG TC；PCR 程序为：94℃ 5 min；94℃ 1min，50℃1min，72℃ 1.5 min，30 个循环；72℃ 10 min。
1.2.2 重组酵母发酵培养
     1）菌种活化：斜面中保存菌在 SC 平板中划线分纯。
     2）增殖培养：分纯后单菌落接入装 15 mL SC 基本培养基的 250 mL 三角瓶中，在 30℃，240 r/min 下振摇 17h。
     3）诱导培养：离心集菌，将细胞悬浮在装有 50 mL SC 诱导培养基的 250 mL 三角瓶中，使诱导培养基初始 OD600为 0.4，在 30℃，240 r/min 下培养，每隔 12 h 取样 1 次，24 h 按 2%浓度添加 1 次半乳糖，培养72 h 发酵结束。
1.2.3 分析方法
     重组酵母菌表达 r-PA 的溶纤维蛋白活性检测：采用纤维蛋白平板法 [4]。发酵液离心后直接点板测定溶圈直径。做回归曲线：用 Excel 建酶活力（C ）和溶圈直径（ A）的回归方程logC = 7.7428log A-6.2443，C -r-PA 酶活力（U/mL）, A -溶解圈直径（mm）。将所得的溶解圈的直径代入回归方程，经计算得 r-PA酶活力。
2 结果与讨论
2.1 重组酵母的 PCR 鉴定
     在选择平板上，随机挑取 8 个酿酒酵母转化子，提取质粒，通过 PCR 技术对它们进行了鉴定，结果如图 1 所示。

         
     由图 1 可见，8 个转化子在 1.1kb 处皆有 PCR产物存在（2～9 泳道），因此它们都是阳性转化
子。第 10 泳道空质粒 pYES2 转化子的 PCR 反应没有相应条带，作为阴性对照，说明已成功将
r-PA 基因导入酿酒酵母中。
2.2 重组酵母生长曲线和表达曲线的测定
     从转化平板上挑取 6 个酿酒酵母转化子菌落，一部分接入选择斜面中保存，一部分直接用
于发酵检测，定时取样测定发酵液在 600 nm 下的吸光值和平板溶圈直径，结果如图 2 和图 3 所示。

    
     由图 2 和图 3 可知，6 株重组酵母菌生长规律较一致，发酵 24 h 后均有 r-PA 表达，发酵 60 h 后其生长和酶活表达均有所降低，确定其发酵周期为 72 h。发酵过程中最高酶活可达 1 926 U/L。其中 1 号菌株生长及酶活力均优于其它菌株，采用此菌株进行下步发酵条件的优化。
2.3 半乳糖诱导浓度对 r-PA 表达的影响
    1 号菌株增值培养后，选择 1%，1.5%，2%，2.5% 四种半乳糖浓度进行诱导表达，菌体增殖生长条件与初始时一致。定时取样测定发酵液酶活表达情况，结果见图 4。
不同的半乳糖诱导浓度对 r-PA 表达影响较大，当半乳糖诱导浓度为 1.5%时，酶活表达量最高，可达 3126 U/L，酶活较初始提高 62.3%。采用较高的半乳糖浓度 2.5%进行诱导时，r-PA 的表达水平很低，可能是由于碳氮源的比例不协调，导致菌体生长水平不高所造成。
2.4 诱导初始 OD600 对 r-PA 表达的影响
    诱导初始 OD600 值分别为 0.2，0.3，0.4，0.5，0.55 五个水平，半乳糖诱导浓度为 1.5%，结果如图 5。从图 5 可知，初始 OD600 值为 0.3 的接种量有利于发酵液中 r-PA 的积累，发酵液最高酶活可达 3468 U/L，酶活较优化前提高10.9%。因为接入菌体悬液应含有适宜浓度的菌体，如果接种菌体浓度太低，会使对半乳糖利用率降低，导致产酶水平下降。如果浓度太高，会使发酵液粘度增大，导致氧的传递和半乳糖的利用受到阻碍；同时菌体浓度太高会使半乳糖消耗过快，从而无法使 r-PA 表达达到最大。

 
2.5 诱导培养基的起始 pH 值对 r-PA 表达的影响
    选择 5.0，5.5，6.0，6.5，7.0 五个诱导培养基起始 pH值水平进行实验，按诱导培养基初始 OD600值为 0.3 进行转接，半乳糖诱导浓度为 1.5%。测定酶活表达情况，结果见图 6。诱导培养基中起始 pH 为 7.0 时，溶圈直径最大，最高酶活可达 4 694 U/L，较优化前提高 35.3%。菌体生长也比较旺盛，更有利于 r-PA 的表达。由于酵母的产酸作用，培养基 pH 值在发酵过程中持续降低，容易偏离酵母的最
适生长 pH 值（5～6）[5]。培养基的起始为 7.0，可以较好的抑制发酵过程中培养基 pH 值的降低，对菌体的生长及产物的表达有促进作用。
2.6 装液量对 r-PA 表达的影响
    在 250 mL 三角瓶中分别装量 30，40，50，60，70 mL培养液，诱导培养基起始 pH 值为 7.0，其它培养条件不变。菌体生长规律与图 2 一致，酶活表达结果见图 7。发酵液最高酶活可达 5 932 U/L，酶活较优化前提高 26.3%。从图7 可知，装液量为 60 mL 时，发酵液酶活最高。但装液量为 70 mL 时，菌体生长得最好，60 mL 仅次之。从菌体生长和酶活表达综合考虑，选择最佳装液量为 60 mL。

3 结论
    本实验通过 PCR 法确认所得重组酵母已成功导入 r-PA 基因，并对重组酿酒酵母 r-PA 适宜发酵条件进行了探索。最适发酵条件为：半乳糖诱导浓度为 1.5%，诱导起始 OD600为 0.3，起始 pH7.0，250mL 三角瓶最适装液量为 60 mL，诱导 60h 发酵液中最高酶活可达 5 932U/L，较优化前提高了 2 倍。