过量表达苹果酸酶对E.coliFMJ39厌氧混合酸发酵的影响
2007-04-27 20:06:23   来源：中国生物工程杂志   评论：0 点击：

　　苹果酸酶广泛存在于大多数生物体中,在Mn2+或Mg2+存在的情况下,催化苹果酸氧化脱羧生成丙酮酸和CO2,伴随NAD+或NADP+还原为NADH或NADPH,在C3和C4化合物的相互转换过程中起着重要的作用,且对整个代谢过程都至关重要。NAD+为辅酶的苹果酸酶在体内加速了氨基酸和C4 二羧酸中的C进入糖异生途径[1,2],因此苹果酸酶的研究具有重要的理论和实际意义。

　　对苹果酸酶的研究国外开展较早,集中在各种来源的苹果酸酶酶学性质和活性调控方面[2～4]。国内对苹果酸酶研究不多,且对象多为真核生物,原核生物目前只有王金霞等[5]克隆、表达、纯化了E.coliK 12的苹果酸酶。而苹果酸酶对E.coli厌氧混合酸发酵途径(图1)的影响尚未见有报道。

　　实验选择E.coliFMJ39(F ,thr 1,leuB6(Am),pflB1,ldhA9,thi 1)作为宿主,其缺陷了和厌氧发酵相关的pflB1和ldhA9两个基因,分别编码丙酮酸甲酸裂解酶和乳酸脱氢酶,厌氧条件下,前者在丙酮酸代谢为甲酸和乙酸,后者在丙酮酸代谢为乳酸的途径中起着关键作用。同以往报道[6]一样,其在有氧条件下可以正常生长,LB培养基厌氧条件下也能生长,但在基本培养基严格厌氧条件下,不能生长,因为缺陷的pfl基因导致无法合成乙酰辅酶A,丙酮酸在体内积累,无法继续代谢,产生不了足够的ATP用于细胞生长和能量代谢。国内未见有关FMJ39的研究,国外多利用其表达各种外源乳酸脱氢酶基因.

　　本研究在FMJ39中厌氧条件下过量表达了苹果酸酶,加强了其在厌氧混合酸发酵途径中的作用,目的在于通过分析基因导入前后途径中各有机酸含量的变化,进而考察其对FMJ39厌氧混合酸发酵途径的影响,为进一步改造和利用FMJ39生产重要的C4平台化合物丁二酸奠定了基础。

1　材料与方法

1.1　材　料

1.1.1　质粒与菌株　pTrc99a由江昊老师(上海中科伍佰豪生物工程有限公司)惠赠,FMJ39购于耶鲁大学大肠杆菌保藏中心,pGEM Tvector、BL21(DE3)和DH5α由本实验室保藏。

1.1.2　主要试剂　基因组提取试剂盒购自上海华舜生物技术公司,TaqDNA聚合酶、质粒快速提取试剂盒购自上海申能博彩生物科技有限公司,DNA胶回收和片段回收试剂盒(大连宝生物工程有限公司),T4DNA连接酶(Promega公司),限制性内切酶(北京纽英伦公司),胰蛋白胨和酵母粉(OXOID公司),L 苹果酸(Sigma公司)。

1.2　方　法

1.2.1　培养基及培养条件　基本培养基参照文献[6]。有氧培养采用LB培养基。厌氧发酵由有氧培养转接血清瓶,培养基为LB添加1.5%MgCO3和2%Glucose。加入MgCO3的目的是为了控制发酵过程中的pH。厌氧培养条件如下:菌种转接后,从CO2钢瓶中经0.22μm滤器向培养基中充入CO21min,从而保证血清瓶中为厌氧环境,在30℃,200r/min厌氧培养。重组菌培养时,加入氨苄终浓度为100μg/ml。

1.2.2　苹果酸酶基因的克隆　用试剂盒提取DH5α基因组DNA。根据KEGG中公布的sfcA基因序列(JW5238),设计PCR引物,上游引物:5′ GGGATGGATATTCAAAAAAGAGTG 3′,下游引物:5′ CTTAGATGGAGGTACGGCGGTAG 3′。PCR反应条件为95℃,1.5min,55℃,1.0min,72℃,1.5min,共35个循环。纯化PCR产物后与pGEM Tvector连接并转化DH5α,涂布氨苄平板,挑选抗性克隆,提质粒、测序。

1.2.3　pTrc99a sfcA质粒的构建　从pGEM Tvector上扩增目的基因。上游引物:5′ CATGCCATGGATATTCAAAAAAGAGTGAGTG 3′(NcoI),下游引物:5′ CCCAAGCTTTTAGATGGAGGTACGGC 3′(HindIII)。PCR反应条件为95℃,1.5min,63℃,1.0min,72℃,1.5min,共35个循环。纯化扩增出的sfcA基因和pTrc99a质粒分别用NcoI和HindIII双酶切、连接并转化DH5α,涂布氨苄平板,挑选抗性克隆,提质粒进行PCR及EcoRI和EcoRV双酶切鉴定。

1.2.4　重组苹果酸酶有氧和厌氧诱导表达　菌体转化采用CaCl2法。有氧诱导:37℃,200r/min培养菌体至A600达0.5～0.8之间,加入IPTG调整成一定的浓度梯度,30℃诱导8h,超声破碎后取上清即粗酶液,测定酶活和进行SDS PAGE分析。总蛋白浓度测定按照Bradford法,以BSA为标准。厌氧诱导:37℃有氧培养至A600达2.0～2.5之间,以10%接种量转入血清瓶中,选择有氧诱导比酶活最高时的IPTG浓度,诱导10h,按上述方法测定酶活。

1.2.5　酶活检测　标准反应体系如下:100mmol/LHEPES,pH7.5,1mmol/LNAD,5mmol/LL 苹果酸,5mmol/LMnCl2。室温340nm处连续监测吸光值的变化,根据测定的标准曲线换算成底物浓度。酶活定义为1min内,催化1μmolL 苹果酸转化为丙酮酸所需要的酶量为1U。

1.2.6　发酵及代谢物分析　厌氧发酵结束后,分别检测受体菌和重组菌发酵液中甲酸、乙酸、乳酸、丙酮酸、丁二酸、柠檬酸含量,对比各有机酸含量的变化,分析过量表达苹果酸酶引起FMJ39中厌氧混合酸发酵代谢流的变化。

　　葡萄糖用生物传感仪(SBA40C)检测,有机酸用高效液相色谱法(HPLC)检测,色谱柱PrevailOrganicAcid5μ;流动相为25mmol/LKH2PO4,pH2.0,流速1.0ml/min,紫外检测波长215nm。

2　结果与讨论

57.44U/mg,对应受体菌只有0.65U/mg,重组菌比酶活比受体菌提高了87倍。同时SDS PAGE结果表明在大约64kDa的位置上有一明显的诱导蛋白条带,其大小与sfcA的分子量相符[5],且IPTG为0.5mmol/L时,诱导表达的蛋白量最多,可达总蛋白的40%以上,与酶

2.1　苹果酸酶基因的克隆及表达

　　图2(a)为从基因组上扩增出的sfcA片段,与预期的1.7kb一致,经测序鉴定正确后,连接至pTrc99a,质粒鉴定如图2(b)所示,PCR和双酶切鉴定(1300bp)结果均与预期一致,故目的基因已成功插入pTrc99a。图3为质粒构建流程图。

　　有氧表达选取的IPTG浓度依次为0、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0mmol/L,重组菌30℃,200r/min诱导8h后以受体菌为对照,测定酶活并进行SDS PAGE分析,结果分别如图4和5所示。

　　结果表明,重组菌加入IPTG诱导比不加IPTG酶活要高,IPTG浓度为0.5mmol/L时,比酶活最高,为活测定结果一致。

　　厌氧发酵条件下选择0.5mmol/LIPTG诱导表达苹果酸酶。测出的比酶活为23.28U/mg,对应受体菌仅为0.15U/mg,重组菌比受体菌比酶活提高了154倍。SDS PAGE结果见图6。　　结果表明苹果酸酶基因诱导10h和诱导16h至发酵结束都获得了大量表达,说明发酵全程表达水平稳定,同时厌氧条件下受体菌和重组菌的比酶活都有所下降,原因是培养基中添加了葡萄糖,代谢产生了较多的乙酸4.53g/L,一般认为乙酸浓度超过1.0～1.5g/L时,外源基因的表达量会大幅降低。

2.2　发酵及代谢物分析　　在有氧和厌氧表达成功的基础上,以受体菌FMJ39为对照,检测了重组FMJ39厌氧发酵结束时,发酵液中甲酸、乙酸、丙酮酸、乳酸、丁二酸、柠檬酸等有机酸的含量,结果如图7所示。发酵初始培养基的pH值为6.75,葡萄糖浓度19.5～20.5g/L,发酵16h,葡糖糖耗尽,有机酸的产生导致pH下降至6.25,菌体A600增加至6.5左右。

　　37℃,pH6.3时,野生型E.coli厌氧发酵利用20g葡萄糖可以产生1.3g丁二酸,2.4g乙酸和8.0g乳酸[7],乳酸是厌氧发酵中有机酸含量最高的。　　发酵结果表明,甲酸、乙酸、丁二酸是主要的有机酸,没有检测到乳酸,原因是FMJ39中编码乳酸脱氢酶的基因ldhA是完全缺陷的,该结果与文献报道[6,8]一至。ldhA的缺陷导致大量丙酮酸流向甲酸和乙酸以及丁二酸的途径,故三种有机酸的量比野生型E.coli要高。过量表达的苹果酸酶在厌氧发酵中催化从苹果酸到丙酮酸的反应,丙酮酸进而代谢为甲酸和乙酸,导致甲酸和乙酸的量分别比受体菌提高了17.58%和15.27%,由于部分苹果酸转化为丙酮酸,使得丁二酸产生途径中的苹果酸相应减少,最终导致丁二酸的量降低了26.87%,柠檬酸的量变化不大。

　　pfl虽然缺陷了,但甲酸和乙酸的含量较高,原因与培养基成分有关。LB培养基中胰蛋白胨和酵母粉营养丰富,成分复杂,含有各种丰富的氨基酸。厌氧条件下,E.coli中还含有第二种丙酮酸甲酸裂解酶[9],其系统命名为丙酮酸甲酸裂解酶4,催化丙酮酸生成甲酸和乙酰辅酶A,乙酰辅酶A继续代谢生成乙酸。该酶由TdcE基因编码,Tdc操作元是一个多顺反子结构,共编码TdcABCDEFG7个基因,其中TdcB和TdcC基因分别编码L Thr脱氢酶降解L Thr和L Thr透性酶,共同参与L Thr降解途径I,TdcG基因编码L Ser脱氨酶,参与L Ser降解途径。TdcE编码的丙酮酸甲酸裂解酶4和pfl编码的丙酮酸甲酸裂解酶有82%的氨基酸一致性,其酶活也取决于丙酮酸甲酸裂解酶的激活酶,能以丙酮酸作为底物,参与厌氧呼吸和混合酸发酵途径。

　　基本培养基中一般添加满足生物合成的氨基酸浓度为0.005%(w/v)左右,而LB培养基中的L Thr浓度[胰蛋白胨和酵母粉中分别为1.87%和2.73%(w/w)]和L ser浓度[胰蛋白胨和酵母粉中分别为1.29%和3.42%(w/w)]要高得多,高浓度的L Thr和L Ser诱导Tdc操纵元转录,使得TdcE编码的丙酮酸甲酸裂解酶4以丙酮酸为底物,最终代谢生成甲酸和乙酸。　　FMJ39在基本培养基中的发酵结果也证明了上述原因,FMJ39是L Thr缺陷型菌株,故培养基中添加0.005%的L Thr,不加入L ser,葡萄糖浓度提高到2%,相应无机N源NH4Cl的浓度提高到0.5%,培养基中还添加0.15%乙酸钠用于其生物合成,使其在厌氧条件下能够生长。发酵结束后,除去添加的1.5g/L乙酸钠,发酵液中甲酸、乙酸、丙酮酸的浓度分别为2.5g/L、2.8g/L和3.02g/L,甲酸和乙酸的浓度分别比用LB培养基时降低了36.39%和15.15%,丙酮酸成为积累的主要有机酸,浓度比用LB培养基时提高了2.36倍。结果表明当L Thr浓度仅能满足生物合成需要时,低水平地诱导Tdc操纵元,使得丙酮酸大量积累,无法代谢,最终产生的甲酸、乙酸水平比用LB培养基时的低。所以,TdcE基因编码的丙酮酸甲酸裂解酶4在厌氧的条件下可以部分取代pfl编码的丙酮酸甲酸裂解酶。　　综上所述,FMJ39中过量表达苹果酸酶会影响厌氧混合酸发酵过程中甲酸、乙酸和丁二酸的代谢途径,且即使pfl基因缺陷,当培养基中含有高浓度的L Thr和L Ser时,依然会诱导Tdc操纵元,产生较多的甲酸和乙酸。

3　结论与展望

　　实验成功构建了表达质粒pTrc99a sfcA,有氧和厌氧的条件下在FMJ39中均获得了大量表达,从而加强了一条在厌氧发酵过程中微弱的途径。厌氧发酵结果表明,过量表达苹果酸酶会影响厌氧混合酸发酵中的甲酸、乙酸、丁二酸途径。重组菌甲酸和乙酸产量分别比受体菌提高了17.58%和15.27%,丁二酸的量降低了26.87%,柠檬酸的量变化不大。证实FMJ39编码丙酮酸甲酸裂解酶的pfl基因虽然缺失,但培养基中高浓度的L Thr和L Ser会诱导Tdc操纵元转录,其中TdcE编码的丙酮酸甲酸裂解酶4厌氧条件下可以部分取代pfl基因编码的丙酮酸甲酸裂解酶。　　丁二酸在医药和食品工业中应用广泛[10],目前的实验结果表明,受体菌FMJ39厌氧发酵产丁二酸的量比野生型E.coli要高,鉴于苹果酸酶在苹果酸代谢中的重要作用,而苹果酸又控制着代谢途径中丁二酸的水平。故如缺失FMJ39中的TdcE基因,使得体内丙酮酸过量积累,那么有可能使苹果酸酶在体内催化由丙酮酸到苹果酸的逆向反应[7],苹果酸最终转化为丁二酸,从而有望把FMJ39改造成丁二酸生产菌株。