泰妙菌素摇瓶发酵工艺优化研究
2009-12-15 23:01:45 来源:本站原创 评论:0 点击:
吴 致军 张萍 王果 沙艳玲
(宁夏多维药业有限公司菌种研究所,银川 750006)
[收稿日期] 2008-8-25 [文献标识码] [文章编号] [中图分类号]
[摘要]:泰妙菌素菌种采用正交实验设计对摇瓶发酵配方进行了优化, 使得摇瓶效价(指发酵液中截短侧耳素含量)从4992μg/mL提高到了9850μg/mL ,效价提高了97.32%,并对摇瓶发酵工艺进行了多方面摸索和调整,完成了引进泰妙菌素菌种的消化吸收。
[关键词]:摇瓶效价;优化;正交实验设计
抗生素菌种的摇瓶效价是标志菌种生产能力的重要指标,不仅是验证该菌种种子阶段菌种制备是否正常的依据,而且也是菌种选育过程中用到的首要指标。菌种摇瓶效价正常与否,不仅影响原材料验证、工艺调整和正常生产;而且也决定菌种选育的成与败。为此,我们对种子瓶制备中的菌丝铲取量多少及研磨程度进行研究,用正交实验设计对摇瓶发酵配方进行了优化[1-2],使得摇瓶效价在原工艺的基础上提高了97.32%,达到9850μg/mL,同时对发酵瓶的接种量、通气量及培养周期对摇瓶效价的影响进行了深入研究[3],完成了引进菌种的消化吸收工作。
材料与方法:
1.1 菌种:L2-20080314①宁夏多维药业有限公司国外引进。
1.2 仪器设备:Waters 600高效液相色谱仪(2487型紫外检测器),美国Waters
公司;TDL-5-A型台式离心机;JA203型电子天平,上海海康电子仪器厂;pHS-3C精密pH计,上海精密科学仪器有限公司;SPX-250B-Z型生化培养箱,上海博迅实业有限公司医疗设备厂;CX31RBSF型显微镜,菲律宾奥林巴克公司;组织研磨器以及其它实验室常用的仪器设备。
1.3 原材料:葡萄糖,天京市瑞金特化学品有限公司;玉米浆,华北制药康欣有限 公司;酵母膏,北京奥博星生物技术有限责任公司;黄豆粉,银川市荷兰县豆饼粉厂;豆油,西安邦琪油脂公司;MgSO4·7H2O,天津市大茂化学试剂厂;Ca(NO3)2·4H2O, 天津市大茂化学试剂厂;KH2PO4,天津市永大化学试剂开发中心;NaCl,天津市化学试剂六厂。
1.4试剂和溶液:
甲醇:色谱纯
乙腈:色谱纯
水: 纯化水
氢氧化钾:分析纯
0.02mol/L磷酸缓冲液:称取2.72g磷酸氢二钾到950mL纯化水中,用5%氢氧化钾溶液调pH=7.2,将溶液移至1000mL容量瓶,并用纯化水稀释至刻度。
截短侧耳素标准样品:已知含量≥95.0%
1.5仪器:
高效液相色谱仪:Waters 2695/2487
色谱柱:Waters 4.6×250mm不锈钢柱, 5μm Symmetry C18
1.6效价测定方法:
截短侧耳素是一种二萜烯类抗生素,从截短侧耳素经半合成可得到延胡索酸泰妙菌素。通过用高效液相色谱法测定发酵液中的截短侧耳素含量作为摇瓶效价。
1.6.1操作条件:
流动相为甲醇-1%碳酸铵溶液(6:4,V/V);流速:1.0mL/min;检测波长:212nm;进样量:20μL。截短侧耳素8.02min
1.6.2标准样液的制备:
称取0.02g标准品,于10mL容量瓶中,用甲醇溶解并定容,摇匀即得标准样液。
1.6.3试样测定液的制备:
取发酵液2mL,于100mL浸提瓶中,加入18mL甲醇,用胶塞塞上瓶口,在240转/分的摇床上振荡3h后过滤,用一次性注射器吸取2mL滤液,用针头过滤器(0.45μm)压滤,所得滤液即为试样测定液。
1.6.4测定:
在上述测定条件下,待仪器稳定后,用进样器取试样测定液和标准测定液分别注入色谱仪中,进行测定。
1.6.5效价的计算:
标准品质量(g)×标准品截短侧耳素百分含量×样品峰面积
摇瓶效价(μg/mL)= ×106
标准品峰面积.
1.7 菌丝斜面的制备:用无菌的不锈钢铲在无菌条件下铲取2cm2左右的菌丝体,加入组织研磨器,加入4mL无菌水充分研磨后,用1mL吸管吸取0.2mL接种茄瓶斜面,置温度25℃,湿度50- 55%的培养箱中培养10-12天后,将其保存在4℃冰箱中备用。
1.8 种子瓶菌丝的制备:用无菌的不锈钢铲在无菌条件下铲取2cm2左右的菌丝体,加入组织研磨器,加入4mL无菌水充分研磨后以10%的接种量接种种子瓶,置温度25℃,湿度40-50% ,转速为240转/分钟的摇瓶机上振荡培养 48–72h,用于转接发酵瓶。
1.9 发酵瓶的培养:用培养好的种子瓶菌丝,以10%的接种量转接发酵瓶,置温度25℃,湿度40-50% ,转速为240转/分钟的摇瓶机上振荡培养192h左右放瓶。
2. 结果
2.1 菌丝量多少及研磨程度对种子瓶生长的影响
泰妙菌素在种子瓶制备过程中需要将菌丝用组织研磨器研磨,由于按照原工艺操作,经常出现种子瓶菌丝生长缓慢,或生长不良的现象,直接影响实验进度和生产进度。为了解决这一问题,我们对菌丝铲取量和研磨程度作了比较,用同一只斜面分别铲取2cm2左右 和8cm2左右(原工艺要求),各重复4个平行样,用同一型号的组织研磨器研磨5min,然后接种种子瓶,在240转/分钟摇床上,25℃振荡培养72h,统一测定pH,菌丝浓度(测定方法为:称取种子液10g,3000转/分,离心10分钟,弃去上清液,称得菌丝重量,计算菌丝所占百分比),并观察菌丝形态。结果见图1。
图1 铲取菌丝量及研磨程度对种子瓶菌丝生长的影响
图1结果表明菌丝量少的组,种子瓶菌丝生长相对较快,可能是研磨充分,菌丝剪切程度较好所导致的结果。因此,适当控制菌丝量有利于菌丝的研磨和种子瓶菌丝的生长。
2.2 发酵培养基正交实验设计:
在确定了种子瓶菌丝制备工艺的基础上,对发酵瓶配方中的4种原材料作了四因素三水平(L934)的正交实验设计,其它配比不变,其实验安排和结果如表1和表2。
表1 因素水平表
水 平 | 因 素 | |||
葡萄糖(A) | 黄豆粉(B) | 玉米浆(C) | 酵母膏(D) | |
1 | 3.5 | 2 | 1 | 0.5 |
2 | 5.5 | 3 | 2 | 1 |
3 | 7.5 | 4 | 3 | 1.5 |
表2 摇瓶发酵配方正交实验结果及直观分析
实验号 | 因 素 | 摇瓶效价(μg/mL) | ||||||
A | B | C | D | 1 | 2 | 3 | 平均 | |
1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 8373 | 7648 | 7618 | 7880 |
2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 5245 | 5745 | 5000 | 5330 |
3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 2620 | 3855 | 3438 | 3304 |
4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 7603 | 7650 | 7293 | 7515 |
5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 7050 | 6910 | 7190 | 7050 |
6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 5785 | 5433 | 5073 | 5430 |
7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 10025 | 9623 | 9798 | 9815 |
8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 8450 | 7565 | 6838 | 7618 |
9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 8874 | 8837 | 8800 | 8837 |
K1 | 5504.667 | 8403.333 | 6976.000 | 7922.333 | / | / | / | / |
K2 | 6665.000 | 6666.000 | 7227.333 | 6858.333 | / | / | / | / |
K3 | 8756.667 | 5857.000 | 6723.000 | 6145.667 | / | / | / | / |
R | 3252.000 | 2546.333 | 504.333 | 1776.666 | / | / | / | / |
表3 正交实验结果方差分析
因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F比 | F临界值 | 显著性 |
A | 16296946.88 | 2 | 42.715 | 19.000 | * |
B | 10156621.55 | 2 | 26.621 | 19.000 | * |
C | 381529.556 | 2 | 1.000 | 19.000 | / |
D | 4796534.22 | 2 | 12.572 | 19.000 | / |
e | 381529.56 | 2 | / | / | / |
注:F0.05 (2,2) =19.000
从表2、表3可以看出,7号实验摇瓶效价最高,平均达到9815μg/mL,再通过直观分析和方差分析发现,葡萄糖和黄豆粉对摇瓶效价的影响比较大,为主要因子。根据实验结果选7号配方和A3B1C1D1配方作进一步验证,同时用原配方作为对照,验证结果如表4。
表4 不同培养基摇瓶效价比较
培养基 | 摇瓶效价(μg/mL) | 平均效价(μg/mL) | 相对效价 | ||
第一批 | 第二批 | 第三批 | |||
7号配方 | 9800 | 9650 | 9830 | 9760 | 195.51 |
A3B1C1D1 | 9900 | 9700 | 9950 | 9850 | 197.32 |
原培养基 | 4950 | 4880 | 5146 | 4992 | 100 |
2.3 两种配方放瓶时菌丝情况比较
发酵摇瓶放瓶时两种配方的菌丝情况如图2、图3所示。新配方的摇瓶菌丝呈网状、长、染色深、无菌丝膨大现象仍显得健壮,而原配方发酵摇瓶菌丝则有染色浅的菌丝、膨大菌丝和短节菌丝,菌丝显得衰老,说明经过配方调整,菌丝形态上已经大大改观,菌丝衰老的时间有所推后,有利于抗生素的合成。
图2 新配方发酵瓶放瓶 图3 原配方发酵摇瓶放
时菌丝情况 (1000×) 瓶时菌丝情况
2.4 发酵瓶接种量对摇瓶效价的影响
为了能更进一步提高泰妙菌素菌种的发酵单位,充分发挥菌种的自身潜力,我们对发酵瓶的接种量作了进一步的考察,分别对发酵瓶以6%、8%、10%、12%、15%和20%的接种量接种,观察其对摇瓶效价的影响,结果见图4
图4 不同接种量对摇瓶效价的影响
图4结果表明,接种量对摇瓶效价有一定的影响,在一定的范围内影响有限,针对该菌种,接种量应控制在12%左右为宜。
2.5 通气量对摇瓶效价的影响
通气量是抗生素生产的一个重要因素, 为了考察通气量对该菌种的影响程度, 我们用发酵摇瓶中不同装料量来考察通气量,分别在300mL三角瓶中装30mL、40mL、和50mL发酵培养基,接种量皆为12%, 培养周期为192h进行考察,结果如图5
图5 不同培养基装量对摇瓶效价的影响
图5实验结果表明, 当发酵瓶培养基装量增加时, 摇瓶效价有一定幅度的降低,其中40mL和50mL装量分别比30mL装量的摇瓶效价降低12.15%和12.39%,说明该菌种对空气量有一定的敏感性,在生产和实验中应加以适当的控制和调整。
2.6 发酵周期对摇瓶效价的影响
任何抗生素菌种都有较合适的发酵周期,确定合适的发酵周期,不仅能发挥菌种的内在潜力,而且能正确的确定生产罐的发酵周期范围,从而使发酵罐的利用率达到最大化,达到降低生产成本的目的。发酵周期实验结果见图6。
图6 发酵周期对摇瓶效价的影响
从图6可看出,发酵摇瓶培养到第9天时,摇瓶效价水平基本达到高峰,如果再延长周期效价水平反而会降低,故摇瓶试验的发酵周期选择9天左右为宜。发酵罐周期可参考该周期作进一步调整。
3 讨论
正交实验设计作为一种简单易行的实验方法,广泛应用于各个领域的科学研究,这种试验方法的优点在于,通过较少的实验可以代替较多的全面试验,既节约了实验成本和时间,又能很快确定影响响应值的主要因素,并能确定因素的最佳取值水平。
我们采用正交设计表L934对泰妙菌素的发酵培养基进行了优化,使其摇瓶效价水平比原配方有了大幅提高,充分显示了正交试验的优越性。
参考文献:
[1] 宋大新等主编.微生物学实验技术教程[M].上海:复旦大学出版社:31-85
[2] 张绍镛,严圣武等.质量管理中的试验设计方法[M].北京:北京理工大学出版社 1991:32-119
[3] 焦瑞身.微生物工程[M].北京:化学工业出版社 2003:32-38
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