软腐灵的模拟生产发酵工艺研究与田间应用
2009-06-17 21:27:37   来源：本站原创   评论：0 点击：

 
魏春妹 张春明  吴腾捷  王建明  陶树玉  刘宗镇

    (上海市农业科学院植物保护研究所，上海201106)
  大白菜软腐病(Soft rot of Brassica pekinensis)是由致病细菌Erwinia avoideac及E．carotovora所造成的重要病害。由软腐病造成的早、中熟大白菜产量损失可达30％～50％，严重的田块可毁产绝收；软腐细菌在植物体内潜伏使产品不耐贮藏而遭受的损失可达20％左右。由于化学农药对该病难以防治、抗性育种亦较难奏效，农业措施尚有局限性，惟有生物防治才是上策。

  该类病害的生物防治始于20世纪70年代初，澳大利亚Kerr利用菌株K84防治桃树根癌病的研究成果在全球推广以后，假单胞杆菌属(Pseudomonas spp．)和芽孢杆菌属(Bacillus spp．)的一些种常被选为对付土传病害的生防菌株。腐烂细菌是一大类群，其中以胡萝卜软腐欧文氏菌(Erxvinia carotovora var． carotovora dye)类群最为重要，同时也证明了生长后期和贮藏期所发生的病害主要是由根系侵入而潜伏在维管束中的该种病菌所致。对于这类病害的防治，国内外研究者曾作过各种探索，先后研究用无致病力的细菌素产生菌株(ABPS)、荧光假单胞菌(Pseudomonas．fluorescerls)以及芽孢杆菌属中的一些种来防治大白菜软腐病[1-6]。本研究则在总结国内外学者有关土传病害研究成果的基础上，从控制寄主根际土壤中的病原菌、拮抗菌和寄主三者间的生物平衡出发，运用平皿相互拮抗筛选法，用诸如拮抗率和反拮抗率生物学参数，对病害流行地区寄主的根和根际土壤中的细菌自然类群进行分析，筛选拮抗大白菜软腐病的菌株[7]，为了更好地开发利用“90—2—1—2菌剂”——软腐灵，减少产品成本，提高其产量和田间应用的效果，本文报道该菌剂的模拟发酵工艺与田间应用结果。

1材料与方法

1．1材料

1．1．1菌株假单胞杆菌属(Pseudornonas spp．)90一2—1—2菌株[7]。1．1．2斜面培养基(％)蔗糖1．0，酵母膏0．4，氯化钠0．05，磷酸二氢钠0．05，硫酸镁0．05，琼脂1．8， pH7．2(消前)。

1．1．3液体种子发酵培养基(％)葡萄糖2．0，淀粉1．0，酵母粉2．0，黄豆饼粉1．5，硫酸镁0．05，磷酸二氢钾0．05，碳酸钙0．6，pH7．O～7．2(消前)。

1．1．4发酵罐培养基(％)葡萄糖1．5，淀粉1．0，酵母粉1．5，黄豆饼粉2．0，硫酸镁0．05，磷酸二氢钾0．015，碳酸钙0．6，大豆油、α-淀粉酶适量，pH7．0～7．2(消前)。

1．2菌体培养条件

1．2．1茵种的活化将保藏菌种转接至斜面培养基，29℃恒温培养2～3d。

1．2．2摇瓶发酵将活化后的菌种移入含有70mL培养液的250mL三角瓶内，于30℃，150r／min培养2～3d。

1．2．3发酵罐发酵将茄子瓶斜面菌种移人种子罐于29"C培养(150r／min、空气流量1：1v．v．m．)后，移入发酵罐培养，直叶涡轮式搅拌器，180r／min空气流量1：1v．v-m．，罐压0．5M Pa,28"C培养1d左右，显微计数。

1．2．4  生产工艺流程

保藏菌株活化  29℃．2--3d→  斜面菌株  29℃．2d→  种子罐  29℃．10h、接种量10％→  发酵罐28℃．22h→   放罐  按比例与填充料→  吸附  脱水（至含水量约15%）→  包装

1．3影响产生培养菌落数的参数试验

1．3．1培养温度与时间将培养温度范围为25～35℃；温度梯度为5℃；静止培养148h；振荡培养40h；二级发酵培养液按不同时间取样测定，均设3次重复。

1．3．2 pH试验分别用pH值为4、5、6、7、8、9和10的培养液，振荡培养40h，均设3次重复。pH值均用pH S-GD-A型数字式酸度计测量。

1．3．3通气试验用250mL三角瓶分别装70mL、100mL、130mL培养液，在摇床上以不同转速(150，200r／min)进行振荡培养，测定，均设3次重复。

1．3．4接种量与摇床转速试验用接种量为3％、4％、5％的培养液，在摇床上以不同转速(150，200 r／min)进行振荡培养，测定，均设3次重复。

1．3．5培养基成分试验基本培养基成分为磷酸二氢钾、硫酸镁、碳酸钙等。试验采用四因子，二水平的正交试验，表头为L4(24)。正交表内的A,B、C,D四因子分别为淀粉、黄豆饼粉、葡萄糖、酵母粉的四种不同含量的4个处理，用活菌计数和总菌落数计数法测定，均设3次重复。

1．3．6发酵罐试验将摇瓶所得的模拟发酵工艺条件，运用到发酵罐(1t罐)发酵、培养并测定。

1．3．7发酵产量测定用活菌计数和显微计数法测定。

1．4田间试验

    处理a．浸种加泼浇，播种大白菜时，取软腐灵10g，稀释300倍，以该稀释液浸种30min后，并将菌液泼浇于种子周围的土壤中；处理b．播种前处理同a，不同之处是播种后30d，再以300倍稀释的菌液均匀浇于苗根部周围的土壤中。对照用清水浸种和泼浇。

2结果与讨论

2．1发酵工艺

2．1．1培养温度和培养时间对菌量的影响该菌在25～35℃范围内都能生长，在25、30、35℃静止培养时，平均产菌量(菌落数)分别为0．68×10 8、2．62×10 8、1．09×10sCFU／mL，总平均为1．46×10sCFU／mE；振荡培养结果平均(菌落数)分别为3．12×108、5．41×10s、3．16×10sCFU／mL，总平均为3．90×10sCFU／mL，最适生长温度为30℃。该菌振荡培养出现最大生长量的时间为35h，比静止培养的短113h，经SPSSl0．0统计分析表明，在30℃振荡培养与静止培养效率差异极显著。振荡培养35h即达最大产菌量6．69×10sCFU／mL，而静止培养148h才为3．47×10sCFU／mL，前者为后者的1．93倍(表1)。可见，振荡培养效率之所以如此之高，关键就在于液体振荡培养时能不断地补充溶解氧，同时促使并增加了菌的活动与培养基的接触，极大地改善了培养菌的生长条件。2．1．2 p8对菌量的影响振荡培养40h，测定pH4～10发酵液的菌量显示，该菌最适宜在pH7中性环境中生长，在该培养环境中的产菌落数为9．52×10sCFUImL。SPSSl0．0统计分析结果显示，差异极显著(表2)。

2．1．3通气量对茵量的影响不同装量的培养液及不同的摇床转速，对90-2-1-2菌株的生长都有影响。试验结果表明，250mL三角瓶分别装70mL、100mL、130mL培养液在29℃，经35h培养后，其菌量分别为8．49×10s、4．69×10s、2．51×10scFu／mL。可见，以70mL装量的培养效果为佳，经SPSS10．0统计分析(0．01)差异极显著，其总菌量分别为100mL装量和130mL装量的1．81倍和3．38倍。

2．1．4接种量和摇床转速与菌量的关系  3％、4％、5％接种量在摇床转速200r／min时，菌量分别为2．16×10s、5．12×10s、3．05×10sCFU／mL，平均为3．44×10s czu／mL，而摇床转速在150r／min时，菌量则仅为1．25×10s、3．54×10s、2．11×10scFu／mL，平均为2．30×10sCFU／mL。经SPSS10．0统计分析(0．01)，摇床转速200r／min和4％接种量结果差异极显著。由此可见，摇床转速200r／min的菌量明显高于150r／min；不同的接种量与摇床转速对菌的生长影响极显著；3％、4％、5％的接种量经不同摇床转速的摇瓶发酵后的平均菌量分别为1．71×10s、4．33×10s、2．58×10sCFU／mL，4％的接种量发酵的菌量高于3％和5％接种量。该试验结果证明，该菌需要一定的通气量，只有满足了这一条件，才能使通气量与菌落数成正比关系，即接种量或装量过大，对该菌的生长都不利（表3．表4）。

2．1．5培养基成分试验采用k(2 4)表头的培养基成分正交试验结果表明(表5)，以1．5％葡萄糖，2．0％大豆饼粉，1．0％淀粉，1．5％酵母粉为最适的碳、氮源配合成的发酵培养基所培养出的菌落数最高，为1．25×109cFu／mL，SP~10．0统计分析结果表明列号2的差异显著，也可从表5极差R值看出，四因素影响90-2-1-2细菌生长的主要顺序为葡萄糖=酵母粉>淀粉>大豆饼粉。

  从以上发酵工艺试验结果可见，菌落数的增长和培养的温度、pH、通气量，碳、氮源的选择以及发酵周期的控制有关。由此得出结论，同一菌种在不同工艺条件下的生长繁殖速度和数量是不同的。2．2发酵罐放大试验

  在发酵罐放大试验中，从摇瓶发酵的菌量4．33×10s CFU／mL到上发酵罐(1t)，发酵终点22h，菌量为1．48×10 10CFU／mL。发酵罐发酵的菌量明显高于摇瓶。也由于发酵罐的条件(通气、搅拌等)优于摇瓶的发酵条件，促使该菌生长加快。初步证明了实验室所得的该发酵模拟生产工艺是可行的。但也由于发酵罐的通气量大，而造成能量消耗的增大及水分的蒸发加快，最终引起糖耗的迅速下降而导致被迫放罐。因此，对发酵中间补料等问题需进一步地摸索[8-10]，以求实现生产开发高产低耗的软腐灵菌剂。

    延滞期、对数生长期、稳定期和衰亡期是任何分批发酵微生物细胞群体在整个培养过程中都要经历的四个时期，本发酵需要的最佳时期是对数生长期一稳定期间，该时期的细胞生长繁殖最为旺盛，需要一定量的营养物质供应，此时如能在往发酵罐中滴加营养液的同时，又连续不断地将发酵液恒定地排出，使罐中的微生物生长始终保持在旺盛的稳定阶段，使之pH、营养成分和溶解氧的浓度都由系统外部予以确定和调节保持最佳状态，这样就将大大提高发酵罐的效率，但是，有关连续发酵的污染、菌种变异等许多实际问题尚有待于进一步探讨[11]。

2．3生防制剂软腐灵的田间应用

    在1994～1997年的大白菜软腐病田间防治效果达70％～80％以上，挽回大白菜产量损失20％～40％不等。沪、苏、浙、鲁等省市的试验、示范和推广使用面积约达77．9 hm2。

    从图可见，大白菜经软腐灵浸种、播种后30d浇根处理结果表明，莲座期的死株率为0％，对照为5．0％；包心期3次调查平均死株率为6．7％，而对照组的平均死株率为34．2％，是处理组的5．1倍。从中看出：包心期，死株率呈上升趋势，经软腐灵处理后，则使这一趋势得到有效的控制。

    表6显示，用软腐灵处理87114大白菜，序号1：软腐灵0．75kg／666．7m2浸种和泼浇的防效为44.3％增产率为16.3％；序号2：在序号1的基础上，播种后30d用0.5kg／666．7 m2软腐灵再浇根一次的防效为82．1％，增产率达37．7％。经SPSSIO．0统计分析(O．01)，序号2用软腐灵处理2次差异极显著。从中能够看出，用软腐灵处理2次的防效比只用一次的高，增产效果更好。

    表7进一步显示了在三个不同地区用软腐灵浸种泼浇及播种后30d用软腐灵再浇根，防治大白菜软腐病的小区试验结果防效均在80％以上。经SPSSIO．0统计分析(0．01)结果表明，地区间差异不显著，效果稳定。用0．5，0．75，1．0 kg／666．7m2的3种不同量软腐灵浸种泼浇及播种后30d用软腐灵再浇根一次，其产量分别为1680，1772，1660kg／666．7 m2，而对照仅为860 kg/666．7 m2，经SPSSIO．0统计分析(0．01)结果表明，处理与对照之间的差异极显著。处理比对照分别增产95．O％，106．1％，93．0％；而处理之间差异不显著，这也说明了用一定量的软腐灵按时进行处理2次，均能增产(表8)。

    *处理方式均为用软腐灵浸种+泼浇，播种后30d灌根。

    Treatment mode：Soaking seeds,spraying seedlings and drenching Toots at 30 days after planting·

  拮抗大白菜软腐病菌株90-2-1-2，90-1-3-2和90-2-3—1对20株病原菌的拮抗率和抑菌圈分别为100％、10．8mm；80％、6．6mm；75％、5．9mm。此3株拮抗菌株对病原菌的拮抗率和抑菌圈总平均值分别为85％和7．8 n"ll"n。病原菌对上述3株拮抗菌株的反拮抗率分别为10％，25％和30％，总平均值为21．7％。反抑菌圈分别为0．6mm；O．9mm和1．1mm，总平均值为0．87mm。平皿相互拮抗试验的结果指出，拮抗菌对病原菌的抑制率(85％)为病原菌反抑制率的3．92倍，其中菌株90-2-1-2对病原菌的抑制率(100％)极为显著，为病原菌反抑制率(10％)的10倍n】。王金生等1986 E12j认为：大白菜软腐细菌从寄主幼根表面侵染并繁殖，病菌定殖可使根表发生显著的超微及显微病变。田间试验证明，拮抗细菌能够在植物根际土壤中繁殖，并能向根部聚集，进入根组织内部，再向上转移至茎、叶组织继续繁殖。该实验结果表明拮抗菌和病原菌的作用在植物体内外存在着相关性。许多研究[13-16]副表明：荧光假单胞杆菌细菌能产生抗其它细菌的有效的抗生素；某些细菌会产生对土壤微生物的各种类型包括病原菌在内都有防效的抗生素，抗生作用的本质是一种有机体的代谢产物对另一种有机体生命活动的抑制；微生物在生长着的根上离根尖lcm内迅速定殖，并可能刺激植物生长。本田间小区试验显示由90—2-1-2等拮抗菌株组合而成的生防制剂(软腐灵)不仅对大白菜软腐病的防效可达70％～80％，而且具有促进大白菜生长的作用，表现为用软腐灵处理的植株比对照健壮，叶片浓绿，有明显增产作用。

    本生防制剂软腐灵可强烈抑制软腐病菌的繁殖和生长，可与寄主植株形成互为有利的微生态环境，使该拮抗菌能够产生对病原菌有抑制作用的物质，从而调节病原菌、拮抗菌和寄主三者之间的生物平衡，对假单胞菌属防治细菌性大白菜软腐病的生物技术作出了综合评价。说明了需获得真正有效的生物防治，必须控制寄主根际土壤中病原菌、拮抗菌和寄主三者之间的生物学的平衡。

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